雞冠透明質(zhì)酸工業(yè)化生產(chǎn)條件優(yōu)選

汪 建，謝 鎮(zhèn)，汪 清

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院生化教研室，2.貴州省冶金化工研究所，3.貴州省理化測試分析研究中心，貴州 貴陽550002)

雞冠透明質(zhì)酸工業(yè)化生產(chǎn)條件優(yōu)選

汪 建1，謝 鎮(zhèn)2，汪 清3

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院生化教研室，2.貴州省冶金化工研究所，3.貴州省理化測試分析研究中心，貴州 貴陽550002)

目的 從雞冠中提取透明質(zhì)酸。方法 絞肉機(jī)破碎雞冠。比較打漿與不打漿進(jìn)行酶解后提取的效果，優(yōu)化提取條件。結(jié)果 打漿雖可縮短提取時(shí)間，但得率下降，相對分子質(zhì)量降低。以絞肉機(jī)粉碎兩次。升高溫度至60℃、120目布袋過濾，能較好的除去雜質(zhì)。提取液使用2倍乙醇沉淀較優(yōu)。成品透明質(zhì)酸溶解于水再次酶解，除蛋白質(zhì)雜質(zhì)。結(jié)論 獲得了較優(yōu)的生產(chǎn)條件，成功從雞冠中提取出透明質(zhì)酸。

雞冠;透明質(zhì)酸;工業(yè)化生產(chǎn);優(yōu)選條件

以雞冠為原料工業(yè)化生產(chǎn)透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)，酶解浸提是HA生產(chǎn)中的關(guān)鍵階段，對此已有研究報(bào)道［1］。酶解后對提取液分離、純化，其生產(chǎn)中的影響因素已有分析［2］，本研究在以前報(bào)道的基礎(chǔ)上做了更深入的探索。

1 儀器與試藥

TJ22-A型絞肉機(jī)(廣東恒聯(lián)食品機(jī)械有限公司);ML65-F分體立式膠體磨(上海博生水泵制造有限公司);φ70 cm不銹鋼抽濾罐。

雞冠(產(chǎn)地:山東);粗胰酶(胰蛋白酶比活力≥600 u/g、胰淀粉酶比活力≥7 000 u/g、胰脂肪酶比活力≥4 000 u/g，產(chǎn)地:湖南);硅藻土(60～180目，工業(yè)級);氫氧化鈉和鹽酸均為工業(yè)級。

2 方法與結(jié)果

2.1 HA生產(chǎn)工藝路線

［3］。

2.2 生產(chǎn)條件選擇

2.2.1 雞冠粉碎 雞冠投料100～150 kg，經(jīng)絞肉機(jī)粉碎后，一半再次粉碎后酶解浸提(不打漿)，另一半用膠體磨打漿后酶解浸提(打漿)，對兩組在酶解提取時(shí)間和效果的影響上作了比較研究，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，兩組提取液在酶促反應(yīng)前期，雞冠中HA逐漸溶解和釋放，溶液黏度不斷升高。水解一段時(shí)間后，雞冠中HA大部分溶解入水中，曲線上升到頂點(diǎn)并出現(xiàn)短暫平臺，之后HA自身降解成為主要矛盾，提取液黏度轉(zhuǎn)為下降，提示酶解已進(jìn)行完畢。兩組成品HA檢測數(shù)據(jù)見表1。

圖1 打漿與不打漿對HA提取時(shí)間和黏度變化的影響Fig.1 Effect on HA in time of its extraction and change of its viscosity whether cockscomb is made into pulp of meat or particles of meat

表1 打漿組與不打漿組各種參數(shù)變化的比較Tab.1 Comparison between the changes of various parameters of groups whether cockscomb is broken or not

打漿組提取高峰出現(xiàn)在6～7 h，比不打漿組高峰出現(xiàn)時(shí)間縮短3 h。但打漿過程同時(shí)破壞了HA，使成品中大分子HA減少，小分子HA增多，并不易被兩倍乙醇沉淀下來，導(dǎo)致收率下降、黏度下降。鑒于打漿對HA的破壞，在HA的提取中，選擇用絞肉機(jī)進(jìn)行兩次粉碎，然后再提取的方法更優(yōu)。

2.2.2 酶解提取HA中監(jiān)控指標(biāo)的確定 在提取HA的工藝中，尋找簡便易操作的質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)，是保證HA生產(chǎn)質(zhì)量及收率的重要前提。經(jīng)反復(fù)對比研究，發(fā)現(xiàn)HA在提取液中的溶解量及相對分子質(zhì)量(Mr)，與提取液黏度大小呈正相關(guān)變化。在生產(chǎn)實(shí)踐中，采用測定提取液黏度作為提取效果及終止反應(yīng)的指標(biāo)［1］，對保證HA質(zhì)量十分有效;經(jīng)一段時(shí)間實(shí)際操作后，又簡化為直接讀取“烏氏黏度計(jì)”中提取液流速時(shí)間作為變量指標(biāo)，省去了換算成黏度的麻煩，使生產(chǎn)中的質(zhì)量監(jiān)控變得非?？焖?、簡單而易操作。

2.2.3 提取過程中攪拌強(qiáng)度的選擇 在HA提取過程中需要不斷加熱以保持45℃恒溫，如果不攪拌，會帶來控溫困難、局部過熱而影響HA的提取。但是，攪拌又產(chǎn)生強(qiáng)大剪切力，破壞HA的Mr。經(jīng)研究，找到了較好的攪拌條件，見表2。攪拌強(qiáng)度過大，對HA造成破壞，提取液黏度下降明顯，不宜用于生產(chǎn)。選擇雙葉平槳、攪拌速度60 r/min，提取效率高，生產(chǎn)時(shí)間短，對黏度影響小，適用于生產(chǎn)。

2.2.4 酶解液過濾條件 酶解液內(nèi)含有雞毛、未溶解的雞冠和雜質(zhì)，由于提取液黏度極大，給過濾帶來困難;使用孔徑大的濾布過濾，在真空抽濾下仍無法進(jìn)行。分析發(fā)現(xiàn)，高黏度的濾液象粥樣斑塊一樣，敷在濾布上堵塞濾孔;加硅藻土助濾，仍發(fā)生粥樣斑塊敷在硅藻土上，無法過濾。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確立了提高濾液溫度的方法解決這一難題，而且可以用120目的濾布加硅藻土助濾快速過濾。見表3。

表2 不同攪拌條件對提取液黏度的影響Tab.2 Effect on viscosity of extraction under different conditions of agitation

在生產(chǎn)實(shí)踐中，分離雜質(zhì)的時(shí)間不能拖得太長，否則會帶來HA降解、黏度下降、甚至細(xì)菌生長產(chǎn)生腐敗的情況。55℃時(shí)，雞冠投料150 kg可得提取液400 kg，用直徑70 cm的真空抽濾罐全部過濾完需要20 h以上，并且1 h需要更換濾布1次，提取液損失很大、還容易因?yàn)V液溫度降低而孳生細(xì)菌導(dǎo)致腐敗。65℃過濾雖快，對HA降解的影響也大，不宜使用。所以，在生產(chǎn)中選擇60℃作為過濾溫度比較恰當(dāng)，由于過濾較快，對HA降解的影響不大;濾液在過濾時(shí)溫度自然下降，但仍保持在抑菌的45℃范圍［1］;溫度降低，黏度回升到7.7左右。助濾介質(zhì)硅藻土，180目以上時(shí)易堵塞，60～180目較為理想;濾布的選擇，目數(shù)小的過濾效果不好，目數(shù)大的過濾速度太慢，失去生產(chǎn)意義，而120目比較適中。

表3 120目濾布抽濾下不同溫度對過濾的影響Tab.3 Effect on filtration at different temperatures via a clothing filter of 120 mu

2.2.5 不同乙醇用量沉淀HA對蛋白質(zhì)含量的影響 HA提取液經(jīng)反復(fù)除雜質(zhì)及過濾，得到澄明溶液，再用95%乙醇沉淀得HA成品。選用不同比例的乙醇進(jìn)行沉淀，對HA產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量有顯著影響。本研究選用2個(gè)不同批次的提取液，每批次再分為A、B兩組，分別用2.0倍和3.5倍95%乙醇進(jìn)行沉淀，分析不同乙醇用量對HA質(zhì)量的影響，結(jié)果見表4。從表4可見，2倍乙醇沉淀對HA收率雖低于3.5倍乙醇沉淀物，其蛋白質(zhì)的含量也明顯降低，而產(chǎn)品Mr卻顯著升高，葡糖醛酸含量也較高。分析原因，雞冠中的蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解，生成了大小不等的肽鏈和氨基酸，在2倍乙醇沉淀時(shí)，大分子肽鏈與HA一道沉淀了，短肽、寡肽及降解的小分子HA卻留在了上清液中。如果用3.5倍乙醇沉淀時(shí)(低于3.5倍沉淀不完全，大于3.5倍沉淀不增加)，所有的HA和大小肽鏈一起沉淀下來，使產(chǎn)品HA的收率升高，但蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量也明顯升高，從葡糖醛酸含量明顯降低來看，HA的純度受到了影響。因此，在以后的生產(chǎn)中，均采用2倍乙醇沉淀法生產(chǎn)HA，取得了滿意效果。

表4 不同乙醇濃度沉淀對HA中蛋白質(zhì)含量的影響Tab.4 Effect on protein contents when ethanol of different densities is precipitated

2.2.6 二次酶解對HA純度及Mr的影響 本工藝對HA質(zhì)量的控制是比較穩(wěn)定的，特別是蛋白質(zhì)含量可控制在5%～15%。對連續(xù)生產(chǎn)的60批產(chǎn)品作了一個(gè)分類，其中蛋白質(zhì)含量＜5%的占27%，5% ～10%的占25%，10% ～15%的占48%。僅有一批次產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量過高，達(dá)到了24%(企業(yè)定為不合格品)。在生物制品的生產(chǎn)中，難免出現(xiàn)次品，對次品的再處理也是必須研究的課題。為此，本研究選取了4組有代表性的產(chǎn)品(蛋白質(zhì)含量分別代表:24%，10% ～15%，5% ～10%，＜5%)，進(jìn)行了再次酶解除蛋白，工藝流程見圖2。二次酶解純化結(jié)果如表5?？梢姡蚊附獬鞍椎男Ч黠@，4批次蛋白質(zhì)均降至4%以下，但HA的Mr也下降;糖醛酸的含量明顯提高，說明HA得到了純化。

圖2 二次酶解除蛋白的簡單流程圖Fig.2 Simple chart of procedure of second enzymes in relieving protein

表5 不同蛋白質(zhì)含量的HA二次酶解結(jié)果Tab.5 Results when HA is secondly enzymed in different contents of Protein

3 討論

工業(yè)化生產(chǎn)HA的工序中，各種條件的控制都應(yīng)以盡量減少HA的降解為前提，同時(shí)還要兼顧除蛋白質(zhì)的效果。在生產(chǎn)實(shí)踐中體會到，雞冠過度粉碎(打漿)、酶解時(shí)間過長或二次酶解，雖然可以明顯降低蛋白質(zhì)含量，但HA的降解也增大。

在布袋過濾前，提取液溫度從45℃升至60℃，應(yīng)快速完成(本生產(chǎn)用時(shí)大約10 min)，達(dá)溫后立即過濾，以盡量減少高溫持續(xù)時(shí)間，減低對HA降解的影響。

小分子HA在2倍乙醇濃度下不易被沉淀，加大乙醇用量可提高HA的收率，但產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量也增高，還增加了乙醇回收的工作量，增大生產(chǎn)成本，不宜使用。

使用超濾器雖然能起到純化HA的作用，但大規(guī)模生產(chǎn)中不能承擔(dān)處理量而不實(shí)用，因?yàn)樵谏a(chǎn)中增加工作環(huán)節(jié)，就會增加生產(chǎn)時(shí)間、增加污染、增加腐敗，尤其是從氣溫較高的晚春到晚秋，一年中的大部分生產(chǎn)時(shí)間，稍不注意就會導(dǎo)致提取液腐敗，出現(xiàn)次品。

當(dāng)產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量＞15%時(shí)，二次酶解效果較優(yōu)，而非酶解的其他方法純化效果不好。如果蛋白質(zhì)含量＜15%，不宜使用強(qiáng)烈的酶解方法，用十二烷基硫酸鈉(SDS)來純化，可使蛋白質(zhì)含量降至0.5%以下，獲得較高純度的HA。

參考文獻(xiàn):

［1］汪 建，汪 清，謝 鎮(zhèn).酶解條件控制對透明質(zhì)酸工業(yè)化提取的影響［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41(1):20-23.

［2］謝 鎮(zhèn)，汪 建，汪 清.雞冠透明質(zhì)酸工業(yè)化生產(chǎn)中質(zhì)量影響因素分析［J］.中國生化藥物雜志，1993，(4):19-22.

［3］汪 建，謝 鎮(zhèn)，汪 清.雞冠透明質(zhì)酸的工業(yè)化生產(chǎn)［J］.中國生化藥物雜志，1993，(4):16-18.

The optimization of the industrial production conditions of cockscomb hyaluranic acid

WANG Jian1，XIE Zhen2，WANG Qing3
(1.Teaching Department of Biochemistry，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，2.Guizhou Institute of Metallurgical and Chemical Engineering，3.Guizhou Research Center of Physical Test and Chemical Analysis，Guiyang 550002，China)

Purpose To extract hyaluranic acid from cockscomb.Methods and Results It's better to use a mincer to mash cockscomb.The impurities can be effectively removed from the post-enzyme extract via a clothing filter of 120 mu when the temperature is raised to 60℃，and the sedimentation is better via of two times of the ethanol.Hyaluranic acid then gets a second enzyming in water to decrease protein impurities remarkably.Conclusion Extract hyaluranic acid from cockscomb successfully by this method under a better condition of production.

cockscomb;hyaluranic acid;industrial production;optimization

TQ464.5

A

1005-1678(2011)06-0472-04

2010-08-25

汪 建，男，副教授，從事生化藥物提取及中試生產(chǎn)放大研究，Tel:0851-5616294，E-mail:jshuims@qq.com。