膜技術(shù)在酶法生產(chǎn)L-色氨酸中去除蛋白質(zhì)和色素的應(yīng)用研究

韋平和，彭加平，周錫樑

(常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇省應(yīng)用酶工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 常州 213164)

膜技術(shù)在酶法生產(chǎn)L-色氨酸中去除蛋白質(zhì)和色素的應(yīng)用研究

韋平和，彭加平，周錫樑

(常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇省應(yīng)用酶工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 常州 213164)

目的 用超濾-納濾膜分離法去除L-色氨酸酶法轉(zhuǎn)化液中的蛋白質(zhì)和色素。方法 L-色氨酸轉(zhuǎn)化液經(jīng)適當(dāng)處理后，輸入超濾膜和納濾膜設(shè)備，分別收集輸出的清液和濃液，然后檢測其透光率并用加入堿或乙醇方式，檢查轉(zhuǎn)化液中蛋白質(zhì)、色素的去除效果。結(jié)果 在轉(zhuǎn)化液pH調(diào)節(jié)至5.5～6.0、溫度控制在20～25℃的膜分離工藝條件下，經(jīng)超濾-納濾輸出的清液，加入堿或乙醇無蛋白質(zhì)析出，透光率達(dá)85%以上，比使用活性炭脫色處理的濾液高2.7倍。結(jié)論 膜分離法去除轉(zhuǎn)化液中蛋白質(zhì)和色素的效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的絮凝劑沉淀蛋白質(zhì)和活性炭脫除色素，從而為酶法生產(chǎn)L-色氨酸提供了一條綠色、先進(jìn)的純化工藝。

膜分離;L-色氨酸;超濾;納濾;蛋白質(zhì);色素

目前，L-色氨酸的生產(chǎn)方法主要是發(fā)酵法和酶法，發(fā)酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉價原料為碳源，利用谷氨酸棒桿菌、枯草桿菌等L-色氨酸產(chǎn)生菌，經(jīng)微生物細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜代謝而生成L-色氨酸;酶法主要是利用色氨酸酶，經(jīng)酶促反應(yīng)將底物L(fēng)-絲氨酸(L-半胱氨酸或丙酮酸)和吲哚合成 L-色氨酸［1］。酶法以其終產(chǎn)物積累量高、反應(yīng)周期短以及與環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而為人們所重視，Terasawa等［2］以高表達(dá)的E.coli色氨酸酶催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸;韋平和等［3-4］采用自主構(gòu)建的色氨酸酶基因工程菌WW-4，分別催化L-絲氨酸和吲哚、L-半胱氨酸和吲哚合成 L-色氨酸;龐敏等［5］用 E.coli色氨酸酶催化DL-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸;李鑫等［6］以色氨酸酶和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶雙酶催化甘氨酸、甲醛和吲哚合成L-色氨酸。但是，上述酶法合成途徑形成的L-色氨酸轉(zhuǎn)化液，與發(fā)酵法形成的發(fā)酵液一樣，同樣含有菌體、蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)，影響L-色氨酸的提取和純化，有效去除這些雜質(zhì)，則是提高L-色氨酸回收率和產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。

發(fā)酵液或轉(zhuǎn)化液中菌體、蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)的去除方法主要有離心、絮凝、活性炭脫色和膜分離等方法，其中膜分離法是將膜技術(shù)應(yīng)用于物料分離、濃縮、提純的一項新技術(shù)，具有在常溫下進(jìn)行、無相態(tài)變化、節(jié)能和環(huán)保等特點(diǎn)，近年來已在各個工業(yè)領(lǐng)域及科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。本文以酶法合成的并經(jīng)陶瓷膜去除菌體的L-色氨酸轉(zhuǎn)化液為對象，研究了采用超濾膜、納濾膜分離技術(shù)去除L-色氨酸轉(zhuǎn)化液中蛋白質(zhì)和色素的工藝條件，試圖為酶法生產(chǎn)L-色氨酸提供一條綠色、先進(jìn)的純化工藝。

1 材料

L-色氨酸轉(zhuǎn)化液:以本室構(gòu)建的色氨酸酶基因工程菌WW-4，按文獻(xiàn)［4］將底物L(fēng)-半胱氨酸和吲哚經(jīng)酶促反應(yīng)制備獲得。

L-半胱氨酸購自上海康達(dá)氨基酸廠;吲哚購自上海潤捷化學(xué)試劑有限公司;乙醇、氫氧化鈉為分析純;硫酸鎂及其它試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純。

UV-7502PCS紫外可見分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司);PHS-3B型精密酸度計(上海雷磁儀器廠);SenLong 30 L雙層玻璃反應(yīng)釜(北京世紀(jì)森朗實驗儀器有限公司)。

陶瓷膜(國產(chǎn)0.2～80μm濾管)設(shè)備、超濾膜(國產(chǎn)UF-16011W2膜)設(shè)備、納濾膜(美國海德能ESNA1-LF膜)設(shè)備，均為浙江湖州富優(yōu)得膜分離科技有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理

取L-色氨酸轉(zhuǎn)化液20 L，輸入陶瓷膜設(shè)備，去除菌體，分別收集清液和濃液，濃液再加入適量純水洗滌，繼續(xù)收集清液至原轉(zhuǎn)化液體積。

2.2 絮凝與超濾去除轉(zhuǎn)化液中的蛋白質(zhì)

2.2.1 絮凝 將經(jīng)預(yù)處理的轉(zhuǎn)化液升溫至70℃，調(diào)整 pH 8.5 ～9.0，加入 0.4% 硫酸鎂作絮凝劑，沉淀去除蛋白質(zhì)，過濾后檢測濾液的透光率及檢查蛋白質(zhì)去除效果。

2.2.2 超濾 將經(jīng)預(yù)處理的轉(zhuǎn)化液調(diào)整pH 4.2～6.5，在壓力0.18 ～0.24 mPa下輸入超濾膜設(shè)備超濾，分別收集輸出的清液和濃液，然后檢測清液和濃液的透光率，檢查蛋白質(zhì)去除效果。

2.3 二次絮凝并活性炭與超濾-納濾去除轉(zhuǎn)化液中的色素和蛋白質(zhì)

2.3.1 二次絮凝并活性炭 將經(jīng)預(yù)處理的濾液升溫至75 ～80 ℃，調(diào)整 pH 4.5 ～5.0，加入0.2%硫酸鎂和1%活性炭，沉淀去除蛋白質(zhì)和脫除色素，過濾后檢測濾液的透光率，檢查色素脫除及蛋白質(zhì)去除效果。

2.3.2 超濾-納濾 將2.2.2項下的清液在壓力0.6～1.0 mPa下輸入納濾膜設(shè)備，分別收集清液和濃液，然后檢測其透光率，檢查色素脫除和蛋白質(zhì)去除效果。

2.4 透光率的測定

取待檢液約20 mL，調(diào)節(jié)溫度20℃后，取適量置10 mm比色杯，于460 nm波長處測量相對于水的透光率。

2.5 蛋白質(zhì)的檢查

2.5.1 方法1 取待檢液約25 mL，調(diào)節(jié)溫度20℃后，滴入4 mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)整 pH 9.0～10.0，振搖3 min，靜置10 min，觀察是否產(chǎn)生白色絮狀物。

2.5.2 方法2 取待檢液約25 mL，調(diào)節(jié)溫度20℃后，加入無水乙醇3 mL，振搖3 min，靜置10 min，觀察是否產(chǎn)生白色絮狀物。

3 結(jié)果

3.1 超濾去除轉(zhuǎn)化液中蛋白質(zhì)的效果

結(jié)果見表1～2。超濾膜法去除L-色氨酸轉(zhuǎn)化液中蛋白質(zhì)的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于絮凝法。轉(zhuǎn)化液經(jīng)超濾膜分離后的清液檢查蛋白質(zhì)，只出現(xiàn)微量的絮狀物;而絮凝法處理后的濾后轉(zhuǎn)化液，仍能檢出大量蛋白質(zhì)存在。

3.2 超濾-納濾去除轉(zhuǎn)化液中色素及蛋白質(zhì)的效果

結(jié)果見表3～4。L-色氨酸轉(zhuǎn)化液經(jīng)超濾再進(jìn)行納濾膜分離后的清液透光率可達(dá)85%以上，比使用活性炭脫色處理后的濾液高約2.7倍，說明納濾膜分離法比活性炭脫色法對轉(zhuǎn)化液中的色素脫除更為有效。超濾-納濾膜分離后的清液，未檢出蛋白質(zhì)絮狀物，而用絮凝法雖經(jīng)二次加入硫酸鎂沉淀蛋白質(zhì)，仍檢查出有蛋白質(zhì)的白色絮狀物。

3.3 轉(zhuǎn)化液pH對超濾-納濾去除蛋白質(zhì)和膜通量的影響

L-色氨酸轉(zhuǎn)化液pH對膜分離過程去除蛋白質(zhì)的效果有一定影響，在放大實驗時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化液在pH 5.0以下的蛋白質(zhì)去除效果不如在pH 5.0以上的。在pH 5.0以下的膜分離清液中，加入乙醇可略見白色絮狀物，透光率也明顯偏低，而pH 5.0以上的膜分離清液中無白色絮狀物出現(xiàn)，透光率可達(dá)85%以上，結(jié)果如圖1。

表1 硫酸鎂去除轉(zhuǎn)化液中蛋白質(zhì)的效果Tab.1 The efficiency of removing proteins from the conversion solution with magnesium sulfate

表2 超濾去除轉(zhuǎn)化液中蛋白質(zhì)的效果Tab.2 The efficiency of removing proteins from the conversion solution with UF

表3 硫酸鎂并活性炭去除轉(zhuǎn)化液中色素及蛋白質(zhì)的效果Tab.3 The efficiency of removing pigments and proteins from the conversion solution with magnesium sulfate and activated carbon

表4 超濾-納濾去除轉(zhuǎn)化液中色素及蛋白質(zhì)的效果Tab.4 The efficiency of removing pigments and proteins from the conversion solution with UF combined with NF

圖1 不同pH轉(zhuǎn)化液對經(jīng)超濾-納濾后清液透光率的影響Fig.1 Effect of different pH values of conversion solution on transmittance of the clear filtrate after UF-NF membrane filtration

由圖1可知，轉(zhuǎn)化液pH對蛋白質(zhì)的去除效果在pH 6.5為好，但在放大實驗時又發(fā)現(xiàn)pH 6.5的轉(zhuǎn)化液在膜分離過程中膜通量下降較快。選擇pH 5.2，5.7和6.5三種不同 pH 值的L-色氨酸轉(zhuǎn)化液，分別檢測其在膜分離過程中膜通量的變化，結(jié)果見圖2。pH 5.2的轉(zhuǎn)化液在濾過時對選用的ESNA1-LF膜的Zeta電位無太大改變，因此對膜通量影響不大，而pH 6.5的轉(zhuǎn)化液有可能改變了膜的Zeta電位，使膜通量受影響。因此，采用超濾-納濾膜法去除L-色氨酸轉(zhuǎn)化液中的蛋白質(zhì)，綜合考慮多方面的影響，轉(zhuǎn)化液的pH值應(yīng)調(diào)至5.5～6.0較為合適。

圖2 三種pH轉(zhuǎn)化液對納濾過程中膜通量的影響Fig.2 Effect of three kinds of pH value of conversion solution on permeate flux in the NF process

3.4 轉(zhuǎn)化液溫度在膜分離過程中對膜通量的影響

轉(zhuǎn)化液溫度在膜分離過程中對膜通量的影響較大，放大實驗時直接應(yīng)用經(jīng)陶瓷膜去除菌體的L-色氨酸轉(zhuǎn)化液進(jìn)行超濾和納濾，開始溫度約30℃，膜通量90 L/(m2·h)，1 h后溫度升至45℃，膜通量僅40 L/(m2·h)。為考察合適的溫度，本研究比較了在10，20，25，30，35 和 40 ℃ 條件下分離 pH 5.8轉(zhuǎn)化液100 L的膜通量變化，結(jié)果見圖3。在20℃以下膜通量沒有什么變化，35℃以上膜通量在30 min后迅速下降。因此，應(yīng)用膜法去除L-色氨酸轉(zhuǎn)化液中的蛋白質(zhì)和色素，轉(zhuǎn)化液的溫度控制在20～25℃較為合適。

圖3 不同溫度轉(zhuǎn)化液對納濾過程中膜通量的影響Fig.3 Effect of different temperatures of conversion solution on permeate flux in the NF process

4 討論

研究結(jié)果表明，膜分離法對L-色氨酸轉(zhuǎn)化液的蛋白質(zhì)去除效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于絮凝法，究其原因是轉(zhuǎn)化液經(jīng)相對分子質(zhì)量(Mr)7 000超濾膜和Mr500納濾膜分離后，Mr大于500的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)碎片已被截留在濃液中，而絮凝劑是很難將Mr為幾百的蛋白質(zhì)碎片全部凝聚的，活性白土也不可能將全部凝聚的蛋白質(zhì)吸附，故經(jīng)絮凝法處理后的濾后轉(zhuǎn)化液仍殘留較多的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的活性炭脫色法并不能把色素全部脫除，經(jīng)脫色后的濾液透光率只有30%左右，而Mr500的納濾膜則能將小分子色素截留在濃液中，故經(jīng)納濾后的清液透光率能達(dá)到85%以上。目前納濾膜的型號較多，本文未涉及對納濾膜選型的討論，但研究結(jié)果表明用于L-色氨酸轉(zhuǎn)化液的色素脫除，選用ESNA1-LF納濾膜是正確的。

L-色氨酸轉(zhuǎn)化液在pH 5.0以下的蛋白質(zhì)去除效果不如在pH 5.0以上，這可能與轉(zhuǎn)化液中的主要蛋白——色氨酸酶的pI有關(guān)。韋平和等［7］報道重組E.coli色氨酸酶合成反應(yīng)的最適pH為7.0，龐敏等［8］認(rèn)為 E.coli色氨酸酶在 pH 5.5 ～7.5 范圍內(nèi)較穩(wěn)定，Suzuki等［9］發(fā)現(xiàn) Symbiobacterium thermophilum耐高溫色氨酸酶的pI為4.9，據(jù)此推測本文所選用的重組E.coli色氨酸酶，其pI值應(yīng)該明顯高于5.0。在轉(zhuǎn)化液pH為4.2和4.5等明顯低于色氨酸酶pI值(5.0以上)時，色氨酸酶蛋白帶正電荷而影響其凝聚，從而影響超濾-納濾去除L-色氨酸轉(zhuǎn)化液中蛋白質(zhì)碎片的效果。另外，轉(zhuǎn)化液 pH在4.2和4.5等較低情況下，膜的Zeta電位較低，易引起納濾膜對蛋白質(zhì)碎片截留率的下降，也在一定程度上影響轉(zhuǎn)化液中蛋白質(zhì)的去除效果。

轉(zhuǎn)化液溫度在20℃以下膜通量沒有什么變化，35℃以上膜通量在30 min后迅速下降。這一結(jié)果與其它應(yīng)用膜技術(shù)分離氨基酸方面的報道不同［10-11］，究其原因，這些研究者處理的是發(fā)酵液，菌體沒有破碎，游離蛋白質(zhì)不多，在較高溫度下有利于溶液黏度下降和擴(kuò)散系數(shù)增大，所以可提高膜通量。然而，酶法生產(chǎn)L-色氨酸需應(yīng)用菌體破碎后游離出的色氨酸酶作為催化劑，并將底物轉(zhuǎn)化為L-色氨酸，因此溶液體系有很大差別。酶法合成的轉(zhuǎn)化液在經(jīng)陶瓷膜去除破碎的菌體后，溶液中仍含有大量的游離蛋白質(zhì)及其碎片。張立卿等［12］認(rèn)為膜具有柔韌性，當(dāng)溫度升高時膜膨脹使得膜孔徑增大，造成膜吸附增加，而膜孔徑增大又易引起膜孔窄化和膜孔堵塞。L-色氨酸轉(zhuǎn)化液中的各種蛋白質(zhì)特別是色氨酸酶，在較高溫度下容易發(fā)生變性而形成較大的絮凝物沉淀，這些蛋白絮凝物易吸附于膜孔內(nèi)，從而導(dǎo)至膜孔堵塞。因此，較高溫度時膜孔徑增大、膜孔窄化和蛋白質(zhì)絮凝物被吸附于膜孔內(nèi)而導(dǎo)致膜孔堵塞，應(yīng)是膜通量下降的主要原因。

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Applied research of removing proteins and pigments in enzymatic production of L-tryptophan with membrane separation technology

WEI Ping-he，PENG Jia-ping，ZHOU Xi-liang
(Applied Enzyme Engineering Technology R＆D Center of Jiangsu，Changzhou Institute of Engineering Technology，Changzhou 213164，China)

Purpose The ultrafiltration(UF)combined with nanofiltration(NF)membrane separation was used to remove proteins and pigments from enzymatic conversion solution of L-tryptophan.Methods The conversion solution of L-tryptophan with certain treatments was inputed into UF and NF membrane filtration equipments，and then clear filtrate and cloudy filtrate through these equipments were collected respectively.The efficiency of removing proteins and pigments from the conversion solution with membrane separation was examined by determining the transmittance of the filtrate and adding alkali or ethanol into the filtrate.Results The conversion solution was adjusted to pH 5.5-6.0，and feeding temperature was 20-25 ℃.Under these operating conditions，no proteins were precipitated from the clear filtrate by adding alkali or ethanol.The transmittance of the clear filtrate at 460 nm was above 85%which was of 2.7 times as high as that of activated carbon decolorization.Conclusion The efficiency of membrane separation for removing proteins and pigments from the conversion solution was obviously better than traditional flocculation precipitation and activated carbon decolorization used in the experiment.It developed a green and advanced purification process for enzymatic production of L-tryptophan.

membrane separation;L-tryptophan;ultrafiltration;nanofiltration;protein;pigment

TQ464.7

A

1005-1678(2011)06-0421-05

2011-06-10

常州市科技攻關(guān)項目(CE20100018);江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”資助項目

韋平和，男，博士，副教授，主要從事生物活性物質(zhì)的發(fā)酵制備和酶法合成研究，Tel:0519-86332163，E-mail:phwei@czie.email.net。