王桂蘭,張曉元,陳曉燕,朱希強(qiáng),凌沛學(xué)
(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院博士后科研工作站,山東 濟(jì)南 250101)
表面活性劑作為黃原膠發(fā)酵促進(jìn)劑的應(yīng)用研究
王桂蘭1,2,張曉元2,陳曉燕2,朱希強(qiáng)1,2,凌沛學(xué)1,2
(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院博士后科研工作站,山東 濟(jì)南 250101)
目的 通過(guò)加入表面活性劑,提高黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量。方法 初步篩選6種常用的表面活性劑,優(yōu)選兩種優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的表面活性劑進(jìn)行加入量、加入時(shí)間、加入比例的優(yōu)化,采用單因素和正交試驗(yàn)得到最佳工藝參數(shù)。結(jié)果吐溫20、曲拉通X-100協(xié)同使用效果最好,發(fā)酵0 h加入0.06%曲拉通X-100,48 h加入0.09%吐溫20,黃原膠產(chǎn)量提高42.0%。結(jié)論 表面活性劑能提高黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量。
黃原膠;發(fā)酵;表面活性劑
黃原膠(xanthan gum),是由甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌或野油菜黃單胞菌,以糖類為主要原料,經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖。因其獨(dú)特的增稠性、觸變性和穩(wěn)定性而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、陶瓷、石油等多種行業(yè)。黃原膠是目前世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的微生物多糖[1],產(chǎn)量為每年10萬(wàn)噸左右,發(fā)酵水平達(dá)到50 g/L[2]。我國(guó)對(duì)黃原膠的開(kāi)發(fā)研究始于20世紀(jì)60年代,目前的生產(chǎn)水平與國(guó)外相比還有較大差距。國(guó)內(nèi)黃原膠主要存在菌種改良、發(fā)酵工藝和后處理工藝優(yōu)化等三個(gè)方面的問(wèn)題[3]。
表面活性劑作為工業(yè)“味精”,在發(fā)酵工業(yè)中主要應(yīng)用于消泡穩(wěn)泡、發(fā)酵生產(chǎn)純粹培養(yǎng)時(shí)的消毒洗滌以及生物下游產(chǎn)品的分離等[4]。表面活性劑能提高很多發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量[4-6],但其在黃原膠發(fā)酵中的應(yīng)用研究則很少。
為了研究表面活性劑對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響,我們?cè)趽u瓶發(fā)酵的條件下,選用6種常用的表面活性劑,采用單因素法和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)等方法,先后優(yōu)化了多個(gè)因素,為表面活性劑作為黃原膠發(fā)酵促進(jìn)劑的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。
野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris 58,Xcc58),本實(shí)驗(yàn)室保存。
3-(3-膽胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)、吐溫80(Tween-80)、吐溫 20(Tween-20)、司班 20(Span-20)、OP乳化劑、曲拉通X-100(Triton X-100)均為市售化學(xué)純。
WFZ UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司;日立CR20B2高速冷凍離心機(jī)。
種子培養(yǎng)基:蔗糖2%,蛋白胨0.3%,酵母粉0.1%,牛肉膏0.5%,pH 值為7.0;固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂。
發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉6%,豆餅粉0.3%,酵母粉0.05%,硫酸鎂 0.25%,碳酸鈣 0.3%,硫酸亞鐵0.001%,pH 值為 7.0。
2.1.1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法 發(fā)酵液用水稀釋適當(dāng)倍數(shù),使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,顯微鏡下計(jì)數(shù),換算成原始發(fā)酵液中菌體密度。
2.1.2 紫外吸收法 參照文獻(xiàn)[7]中菌體處理方法,將發(fā)酵液適當(dāng)稀釋,10 000 r/min離心15 min,去上清。沉淀加入0.01 mol/L鹽酸50 mL,分解剩余的碳酸鈣,5 000 r/min離心10 min后加入水重懸菌體,600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。
采用有機(jī)溶劑(乙醇)沉淀法[7]。
將 Tween-80、Tween-20、OP 乳化劑、Triton X-100均配制成體積分?jǐn)?shù)為10%的水溶液待用,將CHAPS、Span-20均配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的水溶液待用。
菌液平板劃線培養(yǎng)48 h后,挑取單菌落接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h,按5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,250 mL裝液量60 mL,250 r/min,30 ℃培養(yǎng)72 h。
按照2.4 項(xiàng)下方法,在發(fā)酵 0,12,24,36,48,60,72 h取樣,分別用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法和有機(jī)溶劑沉淀法,測(cè)定細(xì)菌密度和黃原膠產(chǎn)量。菌株生長(zhǎng)特性和產(chǎn)膠特性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 菌密度和產(chǎn)膠量變化曲線Fig.1 The variation plot of bacterial density and xanthan gum yield
0~24 h,新接入的菌株生長(zhǎng)緩慢,產(chǎn)膠較少,24~48 h之間,菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生長(zhǎng)較快,同時(shí)產(chǎn)膠率也大幅增加,48 h以后,菌株生長(zhǎng)減緩,但產(chǎn)膠速率仍較大。60 h后,菌株進(jìn)入衰亡期,含量降低,黃原膠產(chǎn)量增長(zhǎng)緩慢。未加表面活性劑前,黃原膠產(chǎn)量約為22 g/L。
選用 CHAPS、Tween-80、Tween-20、Span-20、OP乳化劑和Triton X-100等6種常用的非離子表面活性劑。發(fā)酵起始分別加入0.01%,0.05%,0.1%,0.2%,0.3%等5個(gè)濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以未加入表面活性劑的為對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)圖2~3。
圖2 表面活性劑對(duì)菌密度的影響Fig.2 Effect of diffierent surfactants on bacterial density
圖3 表面活性劑對(duì)產(chǎn)膠量的影響Fig.3 Effect of different surfactants on xanthan gum yield
對(duì)照組中菌體A600為1.328,從圖2可知,加入不同濃度表面活性劑后,發(fā)酵液中菌密度總體呈下降趨勢(shì)。不同表面活性劑對(duì)菌體毒性大小不一,Span-20影響最小,Triton X-100影響最大。
加入CHAPS、Span-20、OP乳化劑后,產(chǎn)膠量隨著濃度的增大呈降低趨勢(shì),但大都高于對(duì)照組黃原膠產(chǎn)量(20.15 g/L)。而加入 Tween-80、Tween-20、Triton X-100后,產(chǎn)膠量呈上升趨勢(shì),在0.2%的加入濃度時(shí),加入Tween-20、Triton X-100的發(fā)酵液,產(chǎn)膠量都達(dá)到23 g/L以上,比對(duì)照組分別提高了14.6%和18.2%。因此優(yōu)選 Tween-20、Triton X-100這2兩種表面活性劑進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。
為了進(jìn)一步探明表面活性劑的作用機(jī)制,得到更高的黃原膠產(chǎn)量,分別對(duì)這兩種表面活性劑的加入時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,在發(fā)酵 0,12,24,36,48 h 分別加入 Tween-20、Triton X-100,終濃度為 0.2%,以未加入表面活性劑的為對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)圖4~5。
如圖4所示,Triton X-100對(duì)菌體的毒性強(qiáng)于Tween-20,但對(duì)于同一種表面活性劑,不同時(shí)間點(diǎn)加入,對(duì)菌密度影響并不明顯。而從圖5可見(jiàn),加入Triton X-100后的產(chǎn)膠量明顯偏高,在0 h加入,產(chǎn)量達(dá)到23.18 g/L,與對(duì)照組的產(chǎn)膠量(19.40 g/L)相比,提高了19.5%。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)加入Triton X-100的發(fā)酵液會(huì)產(chǎn)生大量泡沫,不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。與Triton X-100相比,Tween-20是一種較溫和的表面活性劑,在36 h加入,產(chǎn)膠量達(dá)到了22.79 g/L,比對(duì)照組的產(chǎn)膠量提高了17.5%,略低于加入Triton X-100的發(fā)酵液。綜上所述,Tween-20、Triton X-100這兩種表面活性劑各有利弊,可以考慮共同使用,發(fā)揮協(xié)同效果。
圖4 表面活性劑不同加入時(shí)間對(duì)菌密度的影響Fig.4 Effect of different addition time of surfactants on bacterial density
圖5 表面活性劑不同加入時(shí)間對(duì)產(chǎn)膠量的影響Fig.5 Effect of different addition time of surfactants on xanthan gum yield
為了使Tween-20、Triton X-100達(dá)到較好的協(xié)同效果,將其分別在發(fā)酵0,36 h按照不同濃度比一起加入發(fā)酵液,以單獨(dú)加入Tween-20、Triton X-100的為對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)圖6。
圖6 不同濃度比對(duì)菌密度和產(chǎn)膠量的影響Fig.6 Effect of different addition ratio on bacterial density and xanthan gum yield
結(jié)果表明,由于Triton X-100毒性較大,隨著其加入比例的降低,菌密度呈明顯上升趨勢(shì),產(chǎn)膠量曲線則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在Tween-20、Triton X-100 濃度比為1.5∶1 時(shí),達(dá)到最大值29.28 g/L,比單獨(dú)加入Tween-20和Triton X-100的產(chǎn)膠量分別提高了37.7%和47.3%??梢?jiàn)Tween-20和 Triton X-100確實(shí)存在良好的協(xié)同效果。
為進(jìn)一步驗(yàn)證Tween-20與Triton X-100的協(xié)同效果,得到表面活性劑的最佳加入量和加入時(shí)間,選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平表如表1所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of the orthogonal test
表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果分析Tab.2 Scheme and result of the orthogonal test
由表2極差R可知,4個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大小順序?yàn)锽>C>A>D。正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合為A2B1C1D3。即兩種表面活性劑的最優(yōu)添加工藝為,發(fā)酵0 h加入0.06%Triton X-100,48 h加入0.09%Tween-20。
驗(yàn)證上述正交試驗(yàn)所得最優(yōu)工藝,按照最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行新一批發(fā)酵,設(shè)未加入表面活性劑的對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)得到加入表面活性劑的產(chǎn)膠量達(dá)到30.22 g/L,比對(duì)照組的產(chǎn)膠量(21.28 g/L)提高了42.0%。
傳統(tǒng)理論認(rèn)為[2,8],表面活性劑可以抑制細(xì)胞膜脂肪酸的合成,從而改變細(xì)胞膜的組成成分及其通透性,使發(fā)酵產(chǎn)物更容易滲透出來(lái),從而提高發(fā)酵的產(chǎn)率。近幾年,有人提出一種新型的調(diào)控酮戊二酸脫氫酶活性的作用機(jī)理[2,9],認(rèn)為表面活性劑影響了發(fā)酵體系中蛋白激酶等關(guān)鍵酶的含量。
從本研究結(jié)果可以看出,表面活性劑對(duì)菌體生長(zhǎng)的確有一定作用,加入表面活性劑的發(fā)酵液中菌體密度降低,但是當(dāng)表面活性劑濃度超過(guò)0.1%時(shí),菌體含量降低不明顯,可能因?yàn)楸砻婊钚詣┡c細(xì)胞膜作用基本呈飽和狀態(tài)。
表面活性劑可以作為黃原膠發(fā)酵促進(jìn)劑,在一定程度上提高黃原膠產(chǎn)量。但由于菌種發(fā)酵能力等條件限制,產(chǎn)膠量仍未達(dá)到理想水平。黃原膠生產(chǎn)的發(fā)展方向必定是通過(guò)基因改造、誘變等手段努力提高菌種發(fā)酵能力,在此基礎(chǔ)上不斷研究新型發(fā)酵添加劑,優(yōu)化發(fā)酵條件,進(jìn)一步提高黃原膠產(chǎn)量。
[1]劉清泉.黃原膠產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)食品添加劑,2002(6):5-7.
[2]陳 超,王君高,周喜燕,等.黃原膠發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].中國(guó)釀造,2009(4):121-123.
[3]杜風(fēng)光,陳偉紅,閆德冉,等.我國(guó)黃原膠生產(chǎn)的現(xiàn)狀、存在的問(wèn)題及對(duì)策[J].食品科學(xué),2001,22(10):97-99.
[4]衛(wèi)云路,鄭 成,寧正祥.表面活性劑作為發(fā)酵促進(jìn)劑的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2008,27(7):880-885.
[5]Beom SK,Hak-Ryul K,Ching T H.Effect of surfactant on the production of oxygenated unsaturated fatty acids by Bacillus megaterium ALA2[J].New Biotechnol,2010,27(1):33-37.
[6]Radmacher E,Stansen K C,Besra G S,et al.Ethambutol,a cell wall inhibitor of Mycobacterium tuberculosis,elicits L-glutamate efflux of Corynebacterium glutamicum[J].Microbiol,2005,151(5):1359-1368.
[7]Psomas SK,Liakopoulou-Kyriakides M,Kyriakidis D A.Optimization study of xanthan gum production using response surface methodology[J].Biochem Eng J,2007,35(3):273-280.
[8]Huchenq A,Marquat M,Weiby M,et al.Glutamate excretion triggering mechanism:A reinvestigation of the surfactant-induced modification of cell lipids[J].Ann Microbiol(inst Pasteur),1984,135B(1):53-67.
[9]Niebisch A,Kabus A,Schults C,et al.Corynebacterial protein kinase G controls 2-oxoglutarate dehydrogenase activity via phosphorylation status of the OdhIprotein[J].Biol Chem,2006,281(18):12300-12307.
Study on application of surfactants as the xanthan gum fermentation promoter
WANG Gui-lan1,2,ZHANG Xiao-yuan2,CHEN Xiao-yan2,ZHU Xi-qiang1,2,LING Pei-xue1,2
(1.School of Pharmaceutical Science,Shandong University,Jinan 250012,China;2.Postdoctoral Scientific Research Workstation,Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province,Jinan 250101,China)
Purpose To improve the fermentation yield of xanthan gum by adding surfactants.Methods Six surfactants were tested as accelerants,and two were chosen to optimize the addition dosage,addition time and addition ratio respectively.Monofactorial experiments and orthogonal test were investigated to find out the combined effect of the two kinds of surfactants.Results Tween-20 and Triton X-100 were the best,and by adding 0.06%Triton X-100 in the beginning of fermentation,adding 0.09%Tween-20 at 48 h in the fermentation period,the yield of xanthan gum could be improved 42.0%.Conclusion Surfactants can promote xanthan gum production.
xanthan gum;fermentation;surfactants
RQ464.1
A
1005-1678(2011)06-0429-04
2010-07-20
國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃(編號(hào)2008BAI63B08)
王桂蘭,女,碩士研究生,微生物與生化藥學(xué)專業(yè);凌沛學(xué),男,通信作者,研究員,博士生導(dǎo)師,Tel:0531-81213003,E-mail:peixue.ling@bausch.com。