免疫親和柱——高效液相色譜法檢測(cè)乳制品中玉米赤霉醇及其類似物

張清杰，謝潔，果旗，江帆，王彥斐，王雄，聶長明

（1.南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2.北京中檢維康技術(shù)有限公司，北京 100044）

免疫親和柱
——高效液相色譜法檢測(cè)乳制品中玉米赤霉醇及其類似物

張清杰1，謝潔1，果旗2，江帆2，王彥斐2，王雄2，聶長明1

（1.南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2.北京中檢維康技術(shù)有限公司，北京 100044）

采用高效液相色譜法檢測(cè)牛奶和奶粉中的6種玉米赤霉醇及其類似物，該方法準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高。樣品用乙腈提取，經(jīng)免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明，牛奶和奶粉中添加6種玉米赤霉醇及其類似物回收率均為80%～110%，變異系數(shù)均小于12%。

玉米赤霉醇；類似物；高效液相色譜法；免疫親和柱

0 引 言

玉米赤霉醇是鐮刀霉菌次生代謝產(chǎn)物——玉米赤霉烯酮的還原產(chǎn)物，具有弱雌激素功能，作為生長促進(jìn)劑用于反芻動(dòng)物，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，玉米赤霉醇對(duì)促性腺激素結(jié)合受體等有抑制作用[2]。歐盟于1996年禁止在食用動(dòng)物上使用玉米赤霉醇[3],2002年，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定玉米赤霉醇禁止用于所有食品動(dòng)物，在所有食用組織不得檢出[4]。玉米赤霉烯酮及其代謝產(chǎn)物——α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和β-玉米赤霉醇均可能污染飼料，造成動(dòng)物產(chǎn)品中檢出玉米赤霉醇?xì)埩簟?/p>

目前玉米赤霉醇及其類似物的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[5-6]，高效液相色譜法[7-8]，氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用方法[9]，液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用方法[10-12]和免疫測(cè)定方法[13]等。本文研究了免疫親和柱凈化，高效液相色譜—紫外法測(cè)定牛奶和奶粉中的玉米赤霉醇及其類似物的殘留量，該方法快速，簡(jiǎn)單，可靠，準(zhǔn)確，靈敏。

1 材料與方法

（1）儀器與試劑：高效液相色譜儀（HITACHI），紫外檢測(cè)器（HITACHI），高速離心機(jī)，6種玉米赤霉醇類標(biāo)準(zhǔn)品。

（2）HPLC-UV條件：色譜柱：Cloversil-C18，4.6 mm×250 mm，流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（體積比為43∶7∶50）,流速：0.80 mL/min，柱溫：室溫，檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，波長為265 nm,進(jìn)樣量為20 μL。

（3）玉米赤霉醇及其類似物6種標(biāo)準(zhǔn)品的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：6種混和標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級(jí)甲醇配制，質(zhì)量濃度分別為5,10,20,50,100 μg/L，供液相色譜檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.1 樣品前處理

1.1.1 牛奶

（1）提取。準(zhǔn)確量取牛奶樣品10.0 mL，準(zhǔn)確加入10.0 mL乙腈，搖床震蕩提取20 min，然后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min；準(zhǔn)確吸取上清液10.0 mL，用40 mL純水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，收集濾液于干凈燒杯中。

（2）凈化。 將上述濾液16.0 mL（2.0 mL樣品），以1滴/秒的流速全部通過玉米赤霉醇免疫親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱，隨后用10.0 mL純水以1～2滴/s的流速淋洗親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱，將玻璃小管置于親和柱下，用1.0 mL甲醇以1滴/s淋洗親和柱，將所有樣品淋洗液收集于玻璃測(cè)試管中，于60℃氮?dú)庀麓蹈?，然后用流?dòng)相定容500 μL，注入HPLC檢測(cè)。

1.1.2 奶粉

準(zhǔn)確稱取5 g奶粉，加入50 mL溫水（50℃）溶解充分混勻。然后按照1.1.1牛奶的試驗(yàn)方法操作。

1.2 添加回收實(shí)驗(yàn)

分別選擇牛奶和奶粉樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，牛奶樣品分別添加質(zhì)量濃度為5,10,20 μg/L；奶粉樣品分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15,30,50 μg/㎏。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做5組平行，計(jì)算回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、色譜圖

六種玉米赤霉醇類混和標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度均為：5,10,20,50,100 μg/L，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以各組分濃度與其色譜峰面積進(jìn)行線性回歸,呈良好線性關(guān)系（表1），質(zhì)量濃度為50 μg/L色譜如圖1所示。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.2 方法回收率、精密度

牛奶和奶粉中添加回收結(jié)果為：牛奶中6種玉米赤霉醇類激素藥物的平均回收率為80%～110%（n=5）,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～12%（表2）,奶粉中6種玉米赤霉醇類激素藥物的平均回收率為80%～110%（n=5）,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～11%（表3），這表明該方法穩(wěn)定性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。

采用免疫親和柱進(jìn)行樣品凈化前處理，能夠很大的提高樣品的檢測(cè)靈敏度，牛奶樣品濃縮了5倍，奶粉樣品濃縮了25倍。實(shí)驗(yàn)中液相色譜靈敏度能夠達(dá)到10 μg/L，因此,牛奶的檢測(cè)靈敏度為2.0 μg/L，奶粉的檢測(cè)靈敏度為0.4 μg/kg。

牛奶樣品中添加質(zhì)量濃度為30 μg/L的檢測(cè)色譜圖如圖2所示。

表2 牛奶樣品的添加回收率和精密度

表3 奶粉樣品的添加回收率和精密度

3 結(jié) 論

文章采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜-紫外法檢測(cè)牛奶和奶粉中玉米赤霉醇及其類似物的殘留量，樣品前處理簡(jiǎn)單，免疫親和柱凈化效果明顯，檢測(cè)結(jié)果精密度高,重現(xiàn)性好，該方法適用于牛奶和奶粉中的玉米赤霉醇及其類似物的快速檢測(cè)。

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[3]Council Directive 96/22/EC of 29 April 1996 Concerning the Prohibition on the Use in Stockfarming of Certain Substances Having a Hormonal or Thyreostatic Action and of Beta-agonists（1996）.Off.J.Eur.Commun.L125：3-9.

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Simultaneous determination of zeranol and its analogs in milk and powder milk by high performance liquid chromatography with immunoaffinity clean-up column

ZHANG Qing-jie1,XIE Jie1,GUO Qi2,JIANG Fan2，WANG Yan-fei2,WANG Xiong2,NIE Chang-ming1
（1.University of South China,Hengyang 421001,China；2.Clover Technology Group Limited,Beijing 100044，China）

This work reports a precise,reliable and sensitive multi-residue method for the simultaneous determination of zeranol and its analogs in milk and powered milk by high performance liquid chromatography（HPLC）.The samples were extracted with acetonitrile.After cleaned up by the immunoaffinity column,the analytes were detected by HPLC-UV.The recoveries of six analogs were all in the range of 80%-110%,and the RSDs were less than 12%.

zeranol;analogs;HPLC;immunoaffinity column

TS252.7

A

1001-2230（2011）12-0034-02

2011-10-31

科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金（11C26211103846），北京市科技專項(xiàng)（Z11110205511108）。

張清杰（1986-），女，碩士研究生，從事超微量分析化學(xué)和食品安全檢測(cè)技術(shù)的研究。

聶長明