乳酸菌的適酸性調(diào)節(jié)

喬磊，崔艷華，曲曉軍

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，哈爾濱 150010）

乳酸菌的適酸性調(diào)節(jié)

喬磊1，崔艷華1，曲曉軍2

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，哈爾濱 150010）

探討了乳酸菌適酸機(jī)制有助于抗酸菌株的篩選、發(fā)酵過程中工序的優(yōu)化以及培養(yǎng)基的優(yōu)化等，進(jìn)而大大提升發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)。對(duì)質(zhì)子泵、產(chǎn)堿、細(xì)胞膜變化、大分子保護(hù)修復(fù)以及耐酸調(diào)節(jié)在內(nèi)的適酸性調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了一一闡述。

乳酸菌；質(zhì)子泵；適酸性；調(diào)節(jié)

0 引 言

乳酸菌是能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱。部分乳酸菌為人體內(nèi)必不可少的具有重要生理功能的益生菌。同時(shí)乳酸菌還廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)。

發(fā)酵過程中由于產(chǎn)生乳酸，生存環(huán)境的pH值會(huì)從初始的6.6到6.8降到4.2左右[1]。另外，在人的胃腸道中產(chǎn)生有益作用的乳酸菌，也會(huì)面臨胃液中的低pH環(huán)境。在這種低酸度的不利環(huán)境中，大多數(shù)微生物都會(huì)腐敗裂解死亡。而乳酸菌卻能生存，表明乳酸菌具有較強(qiáng)適酸能力。那么，乳酸菌是如何進(jìn)行適酸性調(diào)節(jié)進(jìn)而生存下來的呢？研究證明，乳酸菌耐酸性調(diào)節(jié)過程中涉及質(zhì)子泵、細(xì)胞膜組成變化、DNA損傷修復(fù)、蛋白質(zhì)損傷修復(fù)以及調(diào)節(jié)子調(diào)控等復(fù)雜過程。乳酸菌的耐酸性調(diào)節(jié)在不同類別的菌群中也存在差異。

1 質(zhì)子泵

該途徑通過去羧基反應(yīng)產(chǎn)生ATP轉(zhuǎn)運(yùn)和消耗胞質(zhì)內(nèi)的H+，從而提高細(xì)胞質(zhì)環(huán)境的pH值。此系統(tǒng)與細(xì)胞質(zhì)環(huán)境中的酶活性有著密切的關(guān)系。

1.1 F1F0-ATP酶

F1F0-ATP酶是一多亞基分子，其既能在消耗ATP的條件下產(chǎn)生分子跨膜動(dòng)力，也能在分子跨膜動(dòng)力的推動(dòng)下產(chǎn)生ATP。分子跨膜動(dòng)力需要將細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中的H+排到胞外，從而使細(xì)胞內(nèi)的pH值升高。F1F0-ATP酶受atp操縱子的編碼調(diào)控。atp操縱子含有編碼F1F0-ATP酶5個(gè)亞基（α,β,δ,γ,ε） 的所有基因。F1（α3 β3 δγε） 組分含有催化亞基， 可以催化ATP的水解。F0（a b c）組分是一個(gè)跨膜的質(zhì)子通道，質(zhì)子經(jīng)過通道進(jìn)入基質(zhì)的過程與ATP的形成偶聯(lián)。研究證明，在另外一條電子傳遞途徑失活狀態(tài)下，F(xiàn)1F0-ATP酶對(duì)于乳酸菌的生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用[2，3]。實(shí)驗(yàn)表明，嗜酸乳桿菌中atp（編碼F1F0-ATP酶亞基）mRNA在低pH條件誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄量明顯增加[4]。

1.2 K+-ATP酶

陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶，例如K+-ATP酶，同樣也對(duì)胞內(nèi)pH的動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用。K+-ATP酶通過胞內(nèi)外K+與H+的交換來調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH的平衡。例如，對(duì)于生長(zhǎng)外界pH值為5.0的變形鏈球菌而言，以葡萄糖為能源的細(xì)胞在缺乏25 mmol/L的K+和有25 mmol/L的K+兩種培養(yǎng)條件下，耐酸能力下降，僅僅可以經(jīng)受5.5和6.14的pH環(huán)境[5]。

1.3 谷氨酸脫羧酶

谷氨酸脫羧酶可通過在脫羧反應(yīng)中消耗H+來調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH。谷氨酸在特定運(yùn)載體的協(xié)助下轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，在谷氨酸脫羧酶的催化作用下消耗H+發(fā)生脫羧反應(yīng)。谷氨酸脫羧反應(yīng)的產(chǎn)物-γ-氨基丁酸，與反向運(yùn)載體結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外[6]。由于H+消耗，胞內(nèi)的pH值上升；同時(shí)，由于相比于谷氨酸酸性更弱的γ-氨基丁酸的產(chǎn)生，胞外pH值也略有上升。研究證明，乳酸桿菌E1亞種丙氨酸脫羧酶催化的谷氨酸脫羧反應(yīng)與胞內(nèi)質(zhì)子的排出形成偶聯(lián)[7]。

2 堿性物質(zhì)的產(chǎn)生

乳酸菌除了通過質(zhì)子泵方式消耗胞內(nèi)質(zhì)子外，也可以通過產(chǎn)生堿性物質(zhì)中和胞內(nèi)質(zhì)子，調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH，主要包括精氨酸脫亞胺酶和脲酶途徑。

2.1 精氨酸脫亞胺酶

精氨酸脫亞胺酶代謝途徑是胞內(nèi)pH平衡的另一有效機(jī)制[8]。這一途徑由精氨酸脫亞胺酶、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和氨基甲酸激酶組成。這三個(gè)酶催化精氨酸轉(zhuǎn)變成鳥氨酸、氨氣和CO2的反應(yīng)，并且反應(yīng)過程中每消耗1 mol精氨酸形成1 mol ATP。反應(yīng)產(chǎn)生的NH3與H+反應(yīng)使環(huán)境堿化，pH值升高。同時(shí)，形成的ATP促使細(xì)胞質(zhì)中的H+在F1F0-ATP酶的作用下排出胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明，在培養(yǎng)基中添加47.5mM精氨酸可以保護(hù)鼠鏈球菌FA-1亞種在pH3.5或4.0環(huán)境中生存至少6 h[9]。

2.2 脲酶

脲酶能夠催化尿素分解生成CO2和NH3（每分子尿素生成兩分子NH3），從而使環(huán)境堿化。人們已經(jīng)在嗜熱鏈球菌和唾液鏈球菌中發(fā)現(xiàn)脲酶的活性。研究證明，脲酶催化的尿素分解代謝能夠保護(hù)唾液鏈球菌長(zhǎng)時(shí)間處在酸環(huán)境中，而不死亡[10]。

3 細(xì)胞膜變化

由于編碼細(xì)胞膜合成、組裝和維修的基因突變，革蘭氏陽性菌對(duì)酸會(huì)很敏感[10]。研究證明，細(xì)胞膜上的脂肪酸組成變化對(duì)于細(xì)胞在pH值下降環(huán)境中生存起著關(guān)鍵的作用。在pH值為5的環(huán)境中成長(zhǎng)的變形鏈球菌，與在pH值為7中生長(zhǎng)的該菌相比，其細(xì)胞膜上單不飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量高[11]。高含量的單不飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸，可以降低H+對(duì)細(xì)胞膜的滲透[1]。另外，乳酸乳球菌中參與肽聚糖合成的特定青霉素結(jié)合蛋白的失活也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)pH的敏感性增加。這些研究充分說明，細(xì)胞膜組成變化，尤其是脂肪酸變化，對(duì)乳酸菌耐酸能力起著至關(guān)重要的影響。

此外，在酸性環(huán)境下，其他機(jī)制可能對(duì)維持細(xì)胞膜的完整性起著一定得作用。例如，在酒類酒球菌中，Lo18（小分子熱休克蛋白）可能參與熱或酸刺激后膜或包膜蛋白的穩(wěn)定[1]。在變形鏈球菌中，低pH條件下，ffh基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)。ffh缺陷型菌株對(duì)酸敏感，并且在低酸度刺激下不能快速加強(qiáng)細(xì)胞膜上F1F0-ATP酶活性，將胞內(nèi)H+及時(shí)排出去[12]。

4 大分子的保護(hù)修復(fù)

對(duì)生物大分子，例如蛋白質(zhì)和DNA，起著保護(hù)修復(fù)的作用的大量蛋白質(zhì)，在乳酸菌的適酸機(jī)制中起著不可缺失的作用。

4.1 蛋白質(zhì)損傷修復(fù)

陪伴蛋白通過蛋白質(zhì)分子的折疊、變性蛋白質(zhì)的復(fù)原保護(hù)以及損傷蛋白質(zhì)的排出等多種方式參與乳酸菌的適酸性調(diào)節(jié)[8]。在幾類乳酸菌關(guān)于適酸性調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究表明，陪伴蛋白經(jīng)常在低pH下高表達(dá)，可能是用來修復(fù)低酸條件下產(chǎn)生的損傷蛋白，或者促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊[6]。大腸桿菌中，陪伴蛋白DnaK低酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的高表達(dá)增強(qiáng)了UrvA（UrvABC的必需亞基，在DNA損傷識(shí)別和核酸酶組裝中起著重要作用）的穩(wěn)定性[13]。這個(gè)觀察表明，陪伴蛋白在適酸調(diào)節(jié)中起作用的原因之一是確保DNA損傷修復(fù)機(jī)制的正常表達(dá)。在乳酸菌中普遍存在的對(duì)適酸性調(diào)節(jié)有作用的陪伴蛋白DnaK和GroEL均屬于熱休克蛋白[14]。變形鏈球菌中的dnaK和groE操縱子以及乳酸乳球菌中的groE和clpP操縱子[15-17]的研究表明，其低pH值誘導(dǎo)是由其常用的熱休克調(diào)控子HrcA和CtsR調(diào)節(jié)。

4.2 DNA損傷修復(fù)

胞內(nèi)環(huán)境的過度酸化會(huì)導(dǎo)致DNA脫嘧啶和脫嘌呤。這個(gè)過程涉及堿基的質(zhì)子化以及隨后的堿基和戊糖之間糖苷鍵的斷裂。堿基缺失位點(diǎn)處保留的殘基稱為脫堿基位點(diǎn)或者AP（apurinic,apyrimidique）位點(diǎn)。在乳酸乳球菌中，溫和的紫外輻射可以誘導(dǎo)產(chǎn)生包括適酸機(jī)制在內(nèi)的幾種應(yīng)激機(jī)制，同時(shí)，四種在適酸反應(yīng)中高表達(dá)的蛋白質(zhì)也會(huì)在DNA損傷治療的誘導(dǎo)下表達(dá)。這表明乳酸菌適酸調(diào)節(jié)機(jī)制可能也包括DNA損傷修復(fù)機(jī)制[6]。變形鏈球菌中，耐乳酸調(diào)節(jié)機(jī)制通過酸誘導(dǎo)的不依賴于RecA的DNA損傷修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)了對(duì)DNA損傷的抗性[18]。這進(jìn)一步證實(shí)了乳酸菌適酸機(jī)制中DNA損傷修復(fù)機(jī)制的存在。

研究表明，pH值為5培養(yǎng)下的變形鏈球菌針對(duì)AP位點(diǎn)的核酸內(nèi)切酶活性增高[19]。同時(shí)其他研究表明，變形鏈球菌的uvrA（uvrA是核苷酸切除修復(fù)機(jī)制的必需成分之一）缺陷型菌株在乳酸耐酸調(diào)節(jié)表現(xiàn)出缺陷，與野生型菌株對(duì)比，在致命pH條件下，存活率下降10倍[20]。因此，在耐酸性調(diào)節(jié)中，這兩種DNA修復(fù)機(jī)制可能同時(shí)起作用。

5 耐酸機(jī)制的調(diào)節(jié)

細(xì)菌通?？梢酝ㄟ^雙組分系統(tǒng)感受細(xì)胞外環(huán)境的變化，并對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)，進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整以適應(yīng)變化的環(huán)境。研究表明，雙組分系統(tǒng)也參與了乳酸菌的耐酸調(diào)節(jié)。在乳酸乳球菌中，幾種雙組分系統(tǒng)缺陷型表現(xiàn)出了與耐酸性調(diào)節(jié)相關(guān)的類型[21]。有研究表明，變形鏈球菌可以通過與群體感應(yīng)相關(guān)的胞外信號(hào)系統(tǒng)來刺激其耐酸性調(diào)節(jié)。

同時(shí)其他系統(tǒng)也參與了乳酸菌耐酸性調(diào)節(jié)。乳酸乳球菌高親和力磷酸運(yùn)載體（pst操縱子）缺陷型菌株對(duì)酸有高耐受性[22]。低pH可以降低磷酸運(yùn)載體的活性，推測(cè)磷酸調(diào)控的調(diào)控子可能在乳酸耐酸調(diào)節(jié)中起著一定作用[8]。乳酸乳球菌rcfB突變型在致死pH條件下的存活率比野生型低130倍，表明RcfB在耐酸調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[22]。另外，乳酸乳球菌中涉及鳥嘌呤核苷酸代謝的基因（guaA，GMP合成酶和relA，（p）ppGpp合成酶）的失活將導(dǎo)致酸抗性[23]。此外，變形鏈球菌中的SGP蛋白（鏈球菌的GTP結(jié)合蛋白，變性鏈球菌的必需GTP酶）可能也參與了耐酸性調(diào)節(jié)過程，其功能之一就是調(diào)節(jié)GTP/GDP含量[24]。

6 展 望

如上文所述，乳酸菌存在多種適酸性調(diào)節(jié)機(jī)制，通常適酸調(diào)節(jié)都是幾種機(jī)制的交叉作用。乳酸菌中存在多種參與適酸性調(diào)節(jié)的基因，其實(shí)際功能及調(diào)節(jié)特點(diǎn)可能會(huì)存在較大差異。要獲得完整地適酸性調(diào)節(jié)機(jī)制信息，需要大量深入工作。乳酸菌全基因組的測(cè)序，毫無疑問地推動(dòng)了適酸性調(diào)節(jié)相關(guān)基因的發(fā)掘和研究。乳酸菌耐酸基因以及機(jī)制的深入研究，勢(shì)必為乳酸菌的深度利用和開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

[1]PENAUD S,FERNANDEZ A,BOUDEBBOUZE S,et al.Induction of Heavy-Metal-Transporting CPX-Type ATPases during Acid Adaptation in Lactobacillus bulgaricus[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72：7445-7454.

[2]BLANK L M,KOEBMANN B J,MICHELSEN O,et al.Hemin Reconstitutes Proton Extrusion in an H+-ATPase-negative Mutant of Lactococcus lactis[J].Journal of Bacteriology,2001,183：6707-6709.

[3]KOEBMANN B J,NILSSON D,KUIPERS O P,et al.The Membrane-bound H+-ATPase Complex is essential for Growth of Lactococcus lactis[J].Journal of Bacteriology,2000,182：4738-4743.

[4]KULLEN M J,KLAENHAMMER T R.Identification of the pH-inducible,Proton-translocating F1F0-ATPase（atpBEFHAGDC）Operon ofLactobacillusacidophilusbydifferentialdisplay：GeneStructure,Cloning and Characterization[J].Molecular Microbiology,1999,33（6）：1152-1161.

[5]DASHPER S G,REYNOLDS E C.pH Regulation by Streptococcus mutans[J].Journal of Dental Research,1992,71：1159-1165.

[6]陳霞,烏日娜,孟和,等.乳酸菌耐酸機(jī)理[J].中國乳品工業(yè),2008,36（3）：30-34.

[7]HIGUCHI T,HAYASHI H,ABE K.Exchange of Glutamate and γ-Aminobutyrate in a Lactobacillus Strain[J].Journal of Bacteriology,1997,179：3362-3364.

[8]VAN DE GUCHTE M,SERROR P,CHERVAUX C,et al.Stress responses in Lactic Acid Bacteria[J].Antonie van Leeuwenhoek,2002,82：187-216.

[9]COLON A C,MARQUIS R E.Role of the Arginine Aeiminase System in Protecting Oral Bacteria and an Enzymatic Basis for Acid Tolerance[J].Applied and Environmental Microbiology,1988,54（6）：1318-1324.

[10]CHEN Y Y,WEAVER C A,BURNE R A.Dual Functions of Streptococcus salivarius Urease[J].Journal of Bacteriology,2000,182：4667-4669.

[11]COTTER P D,HILL C.Surviving the Acid Test：Responses of Gram-Positive Bacteria to Low pH[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2003,67（3）：429-453.

[12]KREMER B H,VAN DER KRAAN M,CROWLEY P J,et al.Characterization of the Sat Operon in Streptococcus mutans：Evidence for a Role of Ffh in Acid Tolerance[J].Journal of Bacteriology,2001,183（8）：2543-2552.

[13]ZOU Y,CROWLEY D J,VAN HOUTEN B.Involvement of Molecular Chaperonins in Nucleotide Excision Repair.DNaK leads to increased Thermal Stability of UvrA,Catalytic UvrB loading,enhanced Repair,and increased UV Resistance[J].Biological Chemistry,1998,273：12887-12892.

[14]CHAMPOMIER-VERGES M C,MAGUIN E,MISTOU M Y,et al.Lactic Acid Bacteria and Proteomics：Current Knowledge and Perspectives[J].Journal of Chromatography B,2002,771：329-342.

[15]LEMOS J A,CHEN Y Y,BURNE R A.Genetic and Physiologic Analysis of the groE Operon and Role of the HrcA Repressor in Stress Gene Regulation and Acid Tolerance in Streptococcus mutans[J].Journal of Bacteriology,2001,183：6074-6084.

[16]HARTKE A,BOUCHE S,GIARD J C,et al.The Lactic Acid Stress Response of Lactococcus lactis subsp.lactis[J].Current Microbiology,1996,33：194-199.

[17]FREES D,INGMER H.ClpP Participates in the Degradation of Misfolded Protein in Lactococcus lactis[J].Molecular Microbiology,1999,31：79-87.

[18]QUIVEY JR R G,FAUSTOFERRI R C,CLANCY K A,et al.Acid Adaptation in Streptococcus mutans UA159 Alleviates Sensitization to Environmental Stress due to RecA Deficiency[J].FEMS Microbiology Letters,1995,126：257-261.

[19]HAHN K,FAUSTOFERRI R C,QUIVEY JR R G.Induction of an AP Endonuclease Activity in Streptococcus mutans during Growth at Low pH[J].Molecular Microbiology,1999,31：1489-1498.

[20]HANNA M N,FERGUSON R J,LI Y H,et al.uvrA is an Acidinducible Gene Involved in the Adaptive Response to low pH in Streptococcus mutans[J].Journal of Bacteriology,2001,183：5964-5973.

[21]O’CONNELL-MOTHERWAYM,VANSINDEREND,MOREL-DEVILLE F,et al.Six Putative Two-component Regulatory Systems Isolated from Lactococcus lactis subsp.cremoris MG1363[J].Genetics and Molecular Biology,2000,146：935-947.

[22]MADSEN S M,HINDRE T,PENNEC J L,et al.Two Acid-inducible Promoters from Lactococcus lactis Require the cis-acting ACiD-box and the Transcription Regulator RcfB[J].Molecular Microbiology,2005,56（3）：735-746.

[23]RALLU F,GRUSS A,EHRLICH S D,et al.Acid-and Multistress-resistant Mutants of Lactococcus lactis：Identification of Intracellular Stress Signals[J].Molecular Microbiology,2000,35：517-528.

[24]BAEV D,ENGLAND R,KURAMITSU H K.Stress-induced Membrane Association of the Streptococcus mutans GTP-binding Protein,an Essential G Protein,and Investigation of its Physiological Role by Utilizing an Antisense RNA Strategy[J].Infection and Immunity,1999,67：4510-4516.

Regulation of acid adaptation in Lactic acid bacteria

QIAO Lei1,CUI Yan-hua1,QU Xiao-jun2
（1.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China；2.Institute of Microbiology,Heilongjiang Science Academy,Harbin 150010,China）

The understanding of acid adaptation mechanisms of LAB will benefit screening the acid-tolerance bacteria,the optimization of procedures in the ferment progress and optimization of culture.This will greatly improve the quality of fermented foods.The acid adaptation mechanisms were discussed,including proton pump,the production of alkali,the changes of membrane,protection or repair of macromolecules and the regulation of acid tolerance.

Lactic acid bacteria；proton pump；acid tolerance；regulation

Q936

B

1001-2230（2011）12-0024-03

2011-07-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30901048）。

喬磊（1990-），男，本科，研究方向?yàn)榉肿游⑸飳W(xué)。

崔艷華