益生菌豆乳發(fā)酵劑的篩選

包艷，蘇芳，董喜梅，姚國強，王水泉，張和平

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018；2.包頭醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014030）

益生菌豆乳發(fā)酵劑的篩選

包艷1,2，蘇芳1，董喜梅1，姚國強1，王水泉1，張和平1

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018；2.包頭醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014030）

為生產(chǎn)出具有良好風(fēng)味和感官特性的發(fā)酵豆乳，選用Lactobacillus plantarum IMAU10156和L.IMAU60042分別與Lacbobacillus acidophilum S21-1，Streptococcus thermophilus S21-2，Bifidobacterium animalis L01-1復(fù)合發(fā)酵豆乳,接種量分別為1×107mL-1，于42℃發(fā)酵和4℃貯藏期間測定菌落總數(shù)、pH值、滴定酸度、黏度及脫水收縮性指標，并在貯藏1 d進行感官鑒評。結(jié)果表明，L.plantarum IMAU10156與S.thermophilus S21-2，L.plantarum IMAU60042與S.thermophilus S21-2復(fù)合具有良好的發(fā)酵特性，在6 h即可到達發(fā)酵終點，發(fā)酵豆乳產(chǎn)品具有純正的豆乳發(fā)酵香味、酸甜適口、組織狀態(tài)良好等特點，是兩組具有開發(fā)價值的益生菌豆乳發(fā)酵劑。

發(fā)酵豆乳；益生菌；發(fā)酵特性

0 引 言

發(fā)酵豆乳（Fermented soymilk）是利用微生物的發(fā)酵作用制成的一種發(fā)酵豆制品。微生物發(fā)酵可分解大豆中的抗營養(yǎng)因子和消除豆腥味，使豆乳變成更易于消化吸收和營養(yǎng)美味的食品[1,2]，同時使大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為活性形式[3-5]，而且還會產(chǎn)生多種功能性多肽如降血壓活性肽等[6]。尤其使用益生菌發(fā)酵劑發(fā)酵豆乳會使產(chǎn)品兼具一種或多種益生特性，增添了產(chǎn)品的營養(yǎng)保健功效。

本研究選用的L.plantarum IMAU10156和L.plan-tarum IMAU60042是我實驗室從102株分離自自然發(fā)酵乳制品及酸粥中的植物乳桿菌中篩選出來的2株具有潛在益生特性的植物乳桿菌，具有較好的耐酸、耐膽鹽、人工胃腸液、凝集和抑制常見胃腸道致病菌的特性。以2株植物乳桿菌分別與嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌相搭配復(fù)合發(fā)酵豆乳，對其發(fā)酵特性進行評價，為進一步研究開發(fā)出具有良好風(fēng)味和感官的發(fā)酵豆乳提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實 驗

1.1 菌株與材料

本實驗所使用的L.plantarum IMAU10156、L.plantarum IMAU60042、L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2、B.animalis L01-1均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供。

MRS（Man Rogosa Sharpe broth）液體、固體培養(yǎng)基，BBL液體、固體培養(yǎng)基配方及材料也由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供。

大豆為市售黑龍江大豆。

1.2 儀器設(shè)備

NSC-II A-1200型無菌工作臺，HITACHI U-2000型分光光度計，HIRAYAMA HA-300MIII型全自動高壓滅菌器，ADVANTEC SP-650型全自動干熱滅菌器，BACKMAN GS-15型離心機，雷磁pHSJ-3F型pH計，STAC-S45F恒溫培養(yǎng)箱，F(xiàn)DM-Z 125-60型漿渣自動分離磨漿機，SRH 60-70型高壓均質(zhì)機，BROOKFIELD DV-E型黏度計等。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及及菌粉的制備

將冷凍干燥保存的菌種L.plantarum IMAU10156、L.plantarum IMAU60042、S.thermophilus S21-2、L.acidophilum S21-1接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)18～22 h，傳代培養(yǎng)2次。

將冷凍干燥保存的菌種B.animalis L01-1接種于BBL液體培養(yǎng)基中，置37℃厭氧培養(yǎng)18～22 h，傳代培養(yǎng)2次。

分別取上述菌種培養(yǎng)液5 mL，經(jīng)3,500×g離心10 min，收集菌體，加入5 mL滅菌生理鹽水洗滌兩次后，混勻制成供試菌懸液，待真空冷凍干燥后菌粉備用。

1.3.2 不同混合菌株在豆乳中發(fā)酵特性

將大豆稱量后用自來水清洗3～4次，用水溫90℃熱水浸泡4 min，再用0.35%的NaHCO3溶液浸泡2 h，瀝干泡豆的水，再清洗3～4次，將大豆與50～55℃的溫水按1︰6的比例磨漿。豆渣中加入適量的溫開水（50～55℃），充分攪拌后，再磨濾2次，3次所得的漿液混勻即成全漿，加水補足，制成豆水比為1∶7的豆?jié){。用120目的篩子過濾，除去豆渣，將豆?jié){連續(xù)煮沸3次。添加質(zhì)量濃度為65 g/L蔗糖，過濾，15～25MPa下二次均質(zhì)。經(jīng)95℃（15 min）殺菌后，冷卻至42℃左右接種，接種量分別為1×107mL-1，混勻，分裝于已滅菌100 mL燒杯中，42℃恒溫培養(yǎng)，每隔3 h取樣測定其菌落總數(shù)、pH值、滴定酸度、黏度及脫水收縮性指標（平行實驗重復(fù)3次，取平均值）。以pH值降到4.5為發(fā)酵終點，將樣品轉(zhuǎn)入4℃冰箱貯藏1 d，取樣測定上述指標并進行感官鑒評[7，8]。

1.3.3 微生物指標的檢測

將發(fā)酵樣品用滅菌PBS梯度稀釋至一定倍數(shù)后，采用平板傾注法，37℃培養(yǎng) （包括含有雙歧桿菌的需要厭氧）24～48 h計菌落總數(shù)，測定各菌株活菌數(shù)[9]。

1.3.4 理化指標檢測

pH值采用精密pH計測量。

滴定酸度測定：取發(fā)酵豆乳9 g，加入10 mL的蒸餾水，混勻，加入2滴酚酞作指示劑，用標準濃度為0.1 mol/L的NaOH滴定。滴定酸度為100 mL發(fā)酵豆乳消耗濃度為0.1 mol/L的NaOH的毫升數(shù)。消耗1 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH相當于1°T[8]。

黏度測定：將發(fā)酵乳樣品調(diào)溫至20～22℃，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度儀4#轉(zhuǎn)子進行測定，其中轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為100 r/min，扭矩為10%～100%，測定時間為30 s。

脫水收縮性測定：稱取15.0 g發(fā)酵豆乳樣品，置于帶有濾紙的漏斗中，室溫放置90 min，收集濾液并稱重[8,10]。脫水收縮性=（濾液質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100%。

1.3.5 凝固型發(fā)酵豆乳的感官鑒評

由5名女性5名男性共10名學(xué)生組成感官鑒評小組，并接受感官鑒評培訓(xùn)。小組成員要求對發(fā)酵豆乳的表觀、氣味、風(fēng)味和質(zhì)地指標進行評價[8,11]。

表觀指標——乳清析出、表面粗糙、黏聚性（保形能力）；

質(zhì)地指標——剖面細膩度、硬度、稠度、拉絲性、平滑性；

氣味指標——豆香味、酸味、臭味、蒸煮味、豆腥味；

風(fēng)味指標——豆香味、豆腥味、酸甜比、苦味、異味、油膩性、澀味。

發(fā)酵豆乳的感官鑒評指標如上所述，感官鑒評得分采用100分制。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件的ANOVA和CORR程序進行方差分析和相關(guān)性統(tǒng)計分析，采用Origin 7.0軟件做圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝乳時間

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復(fù)合發(fā)酵豆乳，各組發(fā)酵豆乳凝乳和發(fā)酵時間測定結(jié)果如表1所示。

表1 各組復(fù)合發(fā)酵豆乳凝乳和發(fā)酵時間

由表1可以看出，發(fā)酵豆乳的凝乳時間越長則所需的發(fā)酵時間越長。各組復(fù)合發(fā)酵豆乳中凝乳和發(fā)酵時間最短的是L.plantarum IMAU10156和L.plantarum IMAU60042分別與S.thermophilus S21-2復(fù)配，凝乳時間僅為3 h，而發(fā)酵6 h即可到達發(fā)酵終點；凝乳和發(fā)酵時間最長的是L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1復(fù)配，用時為7 h和15 h?？梢园l(fā)現(xiàn)，豆乳對于嗜熱鏈球菌來講是非常好的營養(yǎng)基質(zhì)，能夠使其快速的發(fā)酵產(chǎn)酸，雙歧桿菌利用豆乳的效率為其次，而利用率最低的是嗜酸乳桿菌。在研究開發(fā)益生菌發(fā)酵劑時可以考慮添加嗜熱鏈球菌或者雙歧桿菌來加快發(fā)酵速度。

2.2 發(fā)酵和貯藏過程中活菌數(shù)的變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復(fù)合發(fā)酵豆乳，不同發(fā)酵和貯藏時間活菌數(shù)測定結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，發(fā)酵結(jié)束后，各組復(fù)合發(fā)酵豆乳中益生菌L.plantarum IMAU10156與L.plantarum IMAU60042的活菌數(shù)在7.9～9.0 mL-1（對數(shù)值），在貯藏過程中，L.plantarum活菌數(shù)變化不顯著（P＞0.05），基本趨于穩(wěn)定。但對于產(chǎn)品4℃長期貯藏仍能否保持較高的活菌數(shù)，以符合歐盟規(guī)定益生菌產(chǎn)品在其貨架期內(nèi)益生菌活菌數(shù)至少保持在106cfu/g以上的要求[12]，我們?nèi)孕枰獙嵤┭娱L貯藏時間的實驗。研究中我們還發(fā)現(xiàn)，即使是同一菌屬的不同菌株之間存在著某些性質(zhì)的菌株特異性，繼而導(dǎo)致雖分別與同一菌株搭配復(fù)合發(fā)酵豆乳時發(fā)酵特性的不同。

2.3 發(fā)酵和貯藏過程中的pH值變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復(fù)合發(fā)酵豆乳，不同發(fā)酵和貯藏時間pH值測定結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，發(fā)酵過程中各菌株發(fā)酵豆乳的pH值顯著下降（P＜0.05）。其中，S.thermophilus S21-2與兩株植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵在6 h即可到達發(fā)酵終點，pH值下降速率約為0.40 h-1；L.plantarum IMAU60042與B.animalis L01-1復(fù)合發(fā)酵7 h到達終點，pH值下降速率約為0.35 h-1；而L.plantarum IMAU10156與L.acidophilum S21-1復(fù)配、IMAU10156與B.animalis L01-1和L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1的復(fù)合發(fā)酵均較耗時約為10～15 h，導(dǎo)致pH值下降速率僅為0.16～0.24 h-1。顯然，前3組發(fā)酵豆乳所用時間短，對于工業(yè)生產(chǎn)在節(jié)約動力和能源，以及保證產(chǎn)品質(zhì)量方面都有非常大的優(yōu)勢。這主要是由于嗜熱鏈球菌能夠很快的利用豆乳中的糖迅速增殖，生成乳酸致使pH值快速下降的結(jié)果。貯藏1 d后，各復(fù)合發(fā)酵豆乳組pH值變化趨緩。這可能是由于，發(fā)酵過程使乳酸生成量增加，pH值下降，從而使豆乳由中性轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝裕嵝原h(huán)境又使菌體的增殖受到抑制，乳酸的生成速度下降，同時限制了pH值的進一步降低，如此使得pH值在貯藏期間保持了相對的穩(wěn)定性。

2.4 發(fā)酵和貯藏過程中的滴定酸度變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復(fù)合發(fā)酵豆乳，不同發(fā)酵和貯藏時間TA測定結(jié)果如表4所示。

滴定酸度反應(yīng)了包括肽段和游離氨基酸殘基在內(nèi)的所有酸性基團的總和。由表4可知，發(fā)酵過程中各復(fù)合發(fā)酵豆乳的滴定酸度顯著升高（P＜0.05），并且儲藏1 d的過程中仍然會繼續(xù)升高。其中L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1復(fù)合發(fā)酵豆乳的滴定酸度顯著高于其余5組（P＜0.05），而其余5組間變化值無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各組復(fù)和發(fā)酵豆乳中活菌數(shù)隨發(fā)酵和貯藏時間變化（對數(shù)值）mL-1

表3 各組復(fù)合發(fā)酵豆乳pH值隨發(fā)酵和貯藏時間變化

2.5 發(fā)酵及貯藏過程中的黏度變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156、L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2、B.animalis L01-1復(fù)合發(fā)酵豆乳，不同發(fā)酵和貯藏時間黏度測定結(jié)果如表5所示。

由表5可以看出，發(fā)酵過程中各組發(fā)酵豆乳的黏度均顯著升高 （P＜0.05）；L.plantarum IMAU10156和L.plantarum IMAU60042分別與S.thermophilus S21-2復(fù)配、L.plantarum IMAU60042與B.animalis L01-1復(fù)配發(fā)酵豆乳的黏度在發(fā)酵3 h時顯著高于其余3個組（P＜0.05），但是在發(fā)酵結(jié)束和貯藏1 d時，各組黏度無顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于，菌體增殖導(dǎo)致發(fā)酵豆乳中乳酸的含量增加，當達到足夠濃度時，大豆蛋白凝固形成酸凝膠，使黏度迅速增加，菌體代謝受到抑制，乳酸的生成速度下降，限制了黏度繼續(xù)上升，從而使發(fā)酵豆乳黏度保持相對穩(wěn)定[13]。

許多研究表明，很多的S.thermophilus菌株可以產(chǎn)生胞外多糖，可以使酸奶樣品具有良好的拉絲性或比較黏稠的質(zhì)地[14，15]。本研究結(jié)果雖證實了菌株S.thermophilus S21-2對產(chǎn)品質(zhì)地方面的積極影響，但是尚不能確定是否由于其產(chǎn)生胞外多糖所致。

2.6 發(fā)酵及貯藏過程中的脫水收縮敏感性變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum I MAU60042與L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復(fù)合發(fā)酵豆乳，發(fā)酵結(jié)束及貯藏1 d的持水力測定結(jié)果如表6所示。

由表6可以看出，發(fā)酵結(jié)束和貯藏1 d的脫水收縮性最低的是2株植物乳桿菌分別與S.thermophilus S21-2復(fù)合發(fā)酵豆乳產(chǎn)品（P＜0.05），而脫水收縮性最高的是2株植物乳桿菌分別與B.animalis L01-1復(fù)合發(fā)酵豆乳。并且各組發(fā)酵豆乳的脫水收縮性貯藏1 d后比剛剛發(fā)酵結(jié)束時均有所降低。發(fā)酵產(chǎn)品的脫水收縮性越低，說明其產(chǎn)品的持水性越好，發(fā)酵豆乳凝膠體系中束縛水的含量就越多，在不破乳的情況下更能保持產(chǎn)品較好的風(fēng)味和氣味，使產(chǎn)品口感更佳，對于凝固型發(fā)酵豆乳是一個很大的優(yōu)點。

2.7 發(fā)酵豆乳感官鑒評結(jié)果

益生菌的添加有助于提高發(fā)酵產(chǎn)品的感官品質(zhì)[16]，本研究中應(yīng)用2株具有潛在益生特性的植物乳桿菌分別與L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2、B.animalis L01-1復(fù)合制備發(fā)酵豆乳，制得產(chǎn)品的感官鑒評平均分值均在60～90分之間（圖1），尤其是2株植物乳桿菌與S.thermophilus S21-2復(fù)合發(fā)酵豆乳產(chǎn)品，表觀、質(zhì)構(gòu)、氣味和風(fēng)味顯著高于其余4組（P＜0.05），發(fā)酵產(chǎn)品無乳清析出，表面細膩，黏聚性、剖面細膩度、硬度、稠度、拉絲性及平滑性顯著優(yōu)于其他發(fā)酵產(chǎn)品 （P＜0.05）；有明顯豆香味，無臭味、蒸煮味和豆腥味；酸甜表5各組復(fù)合發(fā)酵豆乳黏度隨發(fā)酵和貯藏時間變化/（Pa·s）比例適中，具有悅?cè)说亩瓜阄?，無苦味、異味和澀味，不油膩。得分最低的為L.plantarum IMAU60042與B.animalis L01-1，主要原因是在產(chǎn)品的風(fēng)味和氣味上不及其余5組。

表4 各組復(fù)合發(fā)酵豆乳TA隨發(fā)酵和貯藏時間變化/oT

?

表6 各組復(fù)合發(fā)酵豆乳在發(fā)酵結(jié)束及貯藏1 d的脫水收縮性

圖1中，A組為L.plantarum IMAU10156+L.acidophilum S21-1；B組為L.plantarum IMAU10156+S.thermophilus S21-2；C組為L.plantarum IMAU10156+B.animalis L01-1；D組為L.plantarum IMAU60042+L.acidophilum S21-1；E組為L.plantarum IMAU60042+S.thermophilus S21-2；F組 為L.plantarum IMAU60042+B.animalis L01-1；角標含不同字母的數(shù)據(jù)之間差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié) 論

（1）發(fā)酵試驗中，2株具有潛在益生特性的植物乳桿菌分別與S.thermophilus S21-2復(fù)和發(fā)酵豆乳，凝乳時間為3 h，發(fā)酵時間為6 h；各組復(fù)合發(fā)酵豆乳中益生菌L.plantarum IMAU10156與L.plantarum IMAU60042的活菌數(shù)在7.9～9.0 mL-1（對數(shù)值）， 貯藏過程1 d，L.plantarum活菌數(shù)變化不顯著（P＞0.05）；發(fā)酵期間pH值下降速率和滴定酸度上升速率顯著高于其他組合（P＜0.05）。黏度與其他組結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。

（2）對各組產(chǎn)品進行感官鑒評，其中2株植物乳桿菌與S.thermophilus S21-2復(fù)合發(fā)酵豆乳產(chǎn)品，表觀、質(zhì)構(gòu)、氣味和風(fēng)味顯著高于其他組（P＜0.05），發(fā)酵產(chǎn)品無乳清析出，表面細膩，黏聚性、剖面細膩度、硬度、稠度、拉絲性及平滑性顯著優(yōu)于其他組（P＜0.05）；有明顯豆香味，無臭味、蒸煮味和豆腥味；酸甜比例適中，具有悅?cè)说亩瓜阄叮瑹o苦味、異味和澀味，不油膩。

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Screening of probiotic strain of soymilk fermentation starter culture

BAO Yan1,2，SU Fang1，DONG Xi-mei1，YAO Guo-qiang1，WANG Shui-quan1，ZHANG He-ping1
（1.Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education,Dairy Processing Laboratory of Na tional Dairy production technology and Research Center,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018 China；2.Public health college,Medical College of Baotou,Baotou 014030,China）

To produce fermented soy milk with favorable taste and sensory properties,L.plantarum IMAU10156 and L.plantarum IMAU60042 was repectively combined with L.acidophilum S21-1,S.thermophilus S21-2,B.animalis L01-1 for soy milk fermnetation.The initial inoculation were 1×107cfu/mL and then subjected to fermentation at 42℃followed with a 4℃storage for evaluation of viable counts,pH value,TA,viscosity,syneresis and sensory assessment（1d storage）.The results showed that fermented soy milk in the L.plantarum IMAU10156 and S.thermophilus S21-2,L.plantarum IMAU60042 and S.thermophilus S21-2 group was of better fermented characteristic and pleasing aroma of beans,moderate sweet and great appearance plus with 6h short fermentation time,indicating that it is a promising potential starter cuture for probiotic soy milk fermentation.

fermented soymilk；Probiotics；fermentation properties

TS252.54

A

1001-2230（2011）08-0011-05

2011-05-09

國家科技支撐計劃（2009BADC1B01）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助。

包艷（1977-）,女,博士研究生,從事益生菌方面的研究。

張和平