不同處理對(duì)Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus LB細(xì)胞膜脂肪酸的影響

李揚(yáng)，李妍，劉艷，袁棟棟，張列兵，楊瑞學(xué)

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院，北京 100083）

不同處理對(duì)Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus LB細(xì)胞膜脂肪酸的影響

李揚(yáng)1，李妍1，劉艷1，袁棟棟1，張列兵1，楊瑞學(xué)2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院，北京 100083）

研究了pH值為6.0（溫度為32，37，42和42℃），pH值為5.0和5.5五種培養(yǎng)條件、兩個(gè)不同生長(zhǎng)階段對(duì)Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus LB細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響，以及冷凍干燥過(guò)程中細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化。實(shí)驗(yàn)菌株Lb.LB中主要檢測(cè)到8種脂肪酸。不同處理?xiàng)l件下Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸種類(lèi)一樣，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異。C12：0和C19cyc9質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異最大，變化范圍分別為0.86%～2.16%和4.03%～7.51%。冷凍干燥過(guò)程中Lb.LB細(xì)胞膜中各脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化甚微。

德氏乳桿菌保加利亞亞種；細(xì)胞膜；脂肪酸；冷凍干燥

0 引 言

德氏乳桿菌保加利亞亞種 （Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus）是酸奶生產(chǎn)中常用菌種之一，經(jīng)凍干后以干粉形式存在，可直接用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn)。

在較低的溫度和pH值下培養(yǎng)時(shí)，乳酸菌細(xì)胞的凍干耐受性較高[1，2]；且處于穩(wěn)定期不同階段的乳酸菌細(xì)胞，其對(duì)凍干的耐受性也不相同[3]。Wang Yu等認(rèn)為調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸組成是乳酸菌細(xì)胞在脅迫 （stress）環(huán)境下自我保護(hù)的首選措施[4]。細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量較高時(shí)，細(xì)胞凍干耐受性較好[5-7]。因此，研究不同條件培養(yǎng)及穩(wěn)定期不同階段對(duì)乳酸菌細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響，可以為改善乳酸菌凍干存活率提供一定的理論參考。本文針對(duì)這一問(wèn)題展開(kāi)研究，并進(jìn)一步探討了不同條件培養(yǎng)的Lb.LB細(xì)胞在冷凍干燥過(guò)程中膜脂肪酸組成的變化。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

菌種：德氏乳桿菌保加利亞亞種 （Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus LB，Lb.LB），實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

MRS液體和固體培養(yǎng)基[8]：121℃，15 min滅菌，分別用于菌種活化和活菌計(jì)數(shù)。

改良MRS培養(yǎng)基：121℃，15 min滅菌，用于菌體培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室改良配方。

菌種保藏：懸浮于滅菌（115℃，15 min）的10%脫脂乳（含1%谷氨酸鈉）中，于-40℃冰箱凍存，每次使用前活化。

菌種活化：取原始菌種以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的接種量連續(xù)傳代兩次后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量接種至改良MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 主要設(shè)備

BIOTECH-5BGZA自動(dòng)發(fā)酵罐 （上海保興）、TGL-20M冷凍離心機(jī) （長(zhǎng)沙平凡）、LGJ-10D冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)）。

1.3 方法

1.2.1 不同條件下Lb.LB的培養(yǎng)

采用5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐于pH值為6.0（溫度為32，37，42和42℃），pH值為5.0和5.5培養(yǎng)Lb.LB，取對(duì)數(shù)期末穩(wěn)定期初期懸液，3 000 g，15 min離心；按菌泥︰保護(hù)劑（質(zhì)量濃度比）=1︰（5～6）比例添加保護(hù)劑。-80℃預(yù)凍13 h，真空干燥24 h，冷阱溫度≤55℃，真空度1.0 Pa。

1.2.2 活菌數(shù)測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法，37℃，MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48～72 h后計(jì)數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞膜脂肪酸的測(cè)定

（1）細(xì)胞膜脂肪酸的提取。

分別取預(yù)凍前、預(yù)凍后干燥前、干燥后菌液2 mL，5 000 g，10 min離心，菌體細(xì)胞用相同體積的無(wú)菌水洗滌兩次。在Rozes脂肪酸提取方法的基礎(chǔ)上略作改動(dòng)[9，10]，即上述菌泥中加入1 mL濃度為1 mol/L甲醇鈉的甲醇溶液，劇烈振蕩1 min，加入1.8 mL正己烷溶液，振蕩20 s，2000 g，5 min離心后，取上清，-40℃冰箱密封保存待測(cè)。

（2）氣質(zhì)條件。

使用氣質(zhì)聯(lián)儀分析Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸組成，毛細(xì)管柱為HP-5MS，0.25 mm×30 m×0.25 μm，載氣為高純氦氣，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣。

進(jìn)樣口溫度250℃，柱流速1 mL/min，柱起始溫度60℃，保持1 min，以8℃/min升至200℃，保持2 min，再以15℃/min升至280℃，保持4 min。

質(zhì)譜條件：用電子轟擊源（EI）分析，電子能量70 eV。

1.2.4 脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算

Lb.LB菌株細(xì)胞膜脂肪酸峰面積總和認(rèn)為是100%，根據(jù)每種脂肪酸峰面積占總峰面積的比例計(jì)算脂肪酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即

某種脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)=某脂肪酸峰面積/脂肪酸峰面積總和×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本文中脂肪酸數(shù)據(jù)為兩次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。實(shí)驗(yàn)使用spss17.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)菌株保加利亞乳桿菌Lb.LB細(xì)胞膜中主要檢測(cè)到八種脂肪酸，分別為十二烷酸（C12：0）、十四烷酸（C14：0），十六烯酸（C16：1），十六烷酸（C16：0），十八烯酸（C18：1），十八烷酸（C18：0），十八碳二烯酸（C18：2），dihydrosterculic（9,10-methyleneoctadecanoic，C19cyc9），這些脂肪酸都是乳酸菌細(xì)胞膜中常見(jiàn)的脂肪酸[11-13]。

2.1 不同培養(yǎng)條件下Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸組成

培養(yǎng)溫度對(duì)Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響較大（表1）。 除C14：0和C16：1外，3種不同溫度培養(yǎng)的Lb.LB細(xì)胞膜中其他6種脂肪酸含量均發(fā)生了明顯變化 （P＜0.05），并且不同脂肪酸隨溫度的變化規(guī)律不同。C12︰0在32℃培養(yǎng)的Lb.LB細(xì)胞膜中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于另2種溫度。C16︰0和C18︰1在37℃培養(yǎng)Lb.LB細(xì)胞膜中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，在42℃培養(yǎng)時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低；而C18︰0和C18︰2則正相反，在37℃培養(yǎng)的Lb.LB細(xì)胞膜質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，在42℃培養(yǎng)時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；C19cyc9在37℃培養(yǎng)的Lb.LB細(xì)胞膜中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，42℃培養(yǎng)次之，32℃培養(yǎng)時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。

表1 不同溫度培養(yǎng)時(shí)Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸的組成

不同pH值培養(yǎng)對(duì)Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有顯著影響（見(jiàn)表2），除C16︰0和C18︰1之外，其他細(xì)胞膜脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都因pH值的變化而發(fā)生顯著變化（P＜0.05）。C19cyc9質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著pH值的升高而增加，其他脂肪酸隨pH值變化沒(méi)有明顯規(guī)律。C12︰0在pH值為5.5培養(yǎng)的Lb.LB細(xì)胞膜中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，而pH值為6.0培養(yǎng)時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。C14︰0和C18︰0在pH值為5.0培養(yǎng)的Lb.LB細(xì)胞膜中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，在pH值為5.5培養(yǎng)時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低；而C16：1、C18：2在pH5.0培養(yǎng)的Lb.LB細(xì)胞膜中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，在pH5.5培養(yǎng)時(shí)含量最高。

表2 不同pH培養(yǎng)時(shí)Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸的組成

2.2 不同生長(zhǎng)階段Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸組成

乳酸菌增殖培養(yǎng)通常在菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期收獲菌體，并進(jìn)一步處理制備凍干發(fā)酵劑[14-16]。本研究針對(duì)穩(wěn)定期不同階段Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。穩(wěn)定期初期與中期收獲的Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.3 凍干中Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化

結(jié)果表明，與培養(yǎng)過(guò)程相比，在冷凍干燥過(guò)程中Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸種類(lèi)無(wú)變化，但某些脂肪酸含量發(fā)生了一定變化，并且這種變化因菌株的培養(yǎng)溫度和pH值條件的不同而不同，如圖1和圖2所示。

表3 不同生長(zhǎng)階段Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸的組成

圖1中，pH值控制在6.0，從上至下3個(gè)培養(yǎng)溫度依次為32，37，42℃。

圖2中，溫度控制在42℃，從上至下3個(gè)培養(yǎng)pH值依次為5.0，5.5，6.0。

由圖1和圖2可以看出，在32，37，42℃培養(yǎng)的菌株經(jīng)凍干后細(xì)胞膜中C18︰2，C19cyc9和C18︰0質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別有所增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P＜0.05），其他脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著變化。pH值為5.0培養(yǎng)，細(xì)胞膜脂肪酸組成無(wú)顯著變化（P＞0.05）。pH值為5.5培養(yǎng)，預(yù)凍后C18︰0質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，凍干后C19cyc9質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，差異顯著（P＜0.05），其他脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著差異。

3 討 論

3.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)Lb.LB的影響

有研究結(jié)果表明，微生物細(xì)胞處于不同環(huán)境中，其細(xì)胞膜脂肪酸組成不同[17]。從本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不同溫度和pH培養(yǎng)下Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸的含量不同，但其含量變化與培養(yǎng)溫度和pH無(wú)線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中在32℃和37℃培養(yǎng)下Lb.LB細(xì)胞膜不飽和脂肪酸C16：1和C18：1的含量高于42℃培養(yǎng)，而C18：2質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于42℃培養(yǎng)；pH6.0培養(yǎng)下Lb.LB細(xì)胞膜C19cyc9的含量高于5.0培養(yǎng)，這與Li Chun等報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)pH值控制在6.0時(shí)，較低溫度（30℃）培養(yǎng)下Lactobacillus bulgaricus L2細(xì)胞膜中C16：1和C18：1質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于較高溫度（39℃）培養(yǎng)，而C18：2含量略低于較高溫度培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)溫度控制在39℃時(shí)，pH值為6.0培養(yǎng)下其細(xì)胞膜中cycC19：0質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于pH值為5.0培養(yǎng)[12]。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在較低溫度（32℃）培養(yǎng)下Lb.LB細(xì)胞膜C12：0的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可能與Lb.LB細(xì)胞在較低溫度下的自我調(diào)節(jié)有關(guān)，Chiara Montanari等發(fā)現(xiàn)L.sanfranciscensis細(xì)胞在低溫下可通過(guò)減短膜脂肪酸碳鏈鏈長(zhǎng)，增加短鏈脂肪酸（C12：0）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以維持細(xì)胞膜正常的生理功能[18]。

3.2 不同生長(zhǎng)階段對(duì)Lb.LB的影響

有研究證實(shí)，不同生長(zhǎng)階段的微生物細(xì)胞膜脂肪酸的組成不同，且不同種屬微生物之間，這種脂肪酸組成的變化也不相同[16]。但多數(shù)報(bào)道都認(rèn)為不同生長(zhǎng)階段細(xì)胞凍干存活率的差異和細(xì)胞膜脂肪酸組成有關(guān)[16，17]。在本研究中，Lb.LB在穩(wěn)定期初期和穩(wěn)定期中期細(xì)胞膜脂肪酸組成無(wú)顯著差異（P＞0.05），這可能是由于研究所用菌株與之前文獻(xiàn)報(bào)道的不同，或者所取的樣本都處于穩(wěn)定期內(nèi)的原因所致。然而，分別在這兩個(gè)階段收集的Lb.LB菌體細(xì)胞經(jīng)冷凍干燥后的存活率卻明顯不同（數(shù)據(jù)未給出），這說(shuō)明除細(xì)胞膜脂肪酸之外，可能還有其他因素影響菌體細(xì)胞在冷凍干燥過(guò)程中的存活。

3.3 Lb.LB在冷凍干燥過(guò)程中的變化

關(guān)于保加利亞乳桿菌凍干過(guò)程中細(xì)胞膜脂肪酸組成變化的研究較少，本研究分析了不同培養(yǎng)條件下Lb.LB在凍干中細(xì)胞膜脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，發(fā)現(xiàn)凍干中多數(shù)細(xì)胞膜脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)未發(fā)生變化，只有少數(shù)樣本的脂肪酸含量增加，幅度也不大。溫度為32℃（pH值為6.0）和溫度37℃（pH值為6.0），溫度為42℃（pH值為5.5）培養(yǎng)下Lb.LB細(xì)胞凍干后細(xì)胞膜中C18︰2和C19cyc9質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加，這可能與Lb.LB菌體細(xì)胞膜在凍干脅迫條件下的自我調(diào)節(jié)有關(guān)。有研究認(rèn)為，微生物細(xì)胞面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)細(xì)胞膜脂肪酸的去飽和、形成分支、減短碳鏈鏈長(zhǎng)或形成環(huán)丙烷脂肪酸來(lái)維持細(xì)胞膜正常的生理功能[12、19-21]。在不飽和和環(huán)狀脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)42℃，pH值為6.0培養(yǎng)Lb.LB細(xì)胞凍干后飽和脂肪酸C14︰0和C18︰0質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有所增加，Castro等研究也發(fā)現(xiàn)37℃培養(yǎng)Lactobacillus bulgaricus凍干后細(xì)胞膜飽和脂肪酸含量增加[9]，其原因目前還不清楚。

4 結(jié) 論

當(dāng)溫度為30～42℃和pH值為5.0～5.5波動(dòng)時(shí)，Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化明顯，培養(yǎng)溫度對(duì)Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響比培養(yǎng)pH值大，其中，C12：0和C19cyc9質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異最大，變化范圍分別為0.86%～2.16%和4.03%～7.51%。兩個(gè)不同生長(zhǎng)階段（穩(wěn)定期初期與穩(wěn)定期中期）Lb.LB細(xì)胞膜脂肪酸的組成無(wú)顯著差異。在實(shí)驗(yàn)選擇的凍干工藝下，不同條件培養(yǎng)的Lb.LB在冷凍干燥過(guò)程中細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化不相同，且變化甚微。凍干中細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)機(jī)制還不明確，需要進(jìn)一步研究。

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Effects of different disposes on compositions of membrane fatty acids of Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus LB

LI Yang1,LI Yan1,LIU Yan1,YUAN Dong-dong1,ZHANG Lie-bing1,YANG Rui-xue2
（1.College of Food Science&Natritional Engineening,China Agricultural University,Beijing 100083,China;
2.Chinese Acadency of Agricultural Mechanization Science,Beijing 100083,China）

At pH=6.0,32，37，42 and 42℃,pH=5.0、5.5,the effects of different cultivating temperature,pH and stages on compositions of membrane fatty acids of Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus LB were studied.The changes of membrane fatty acids during freeze-drying were also studied.In different conditions the kinds of fatty acids retained the same,while the content of fatty acids differed from each other,especially the C12：0 and C19cyc9.The content of C12：0 and C19cyc9 ranged from 0.86%to 2.16%and from 4.03%to 7.51%,respectively.Almost,no significant changes of the content of fatty acids had been discovered during freeze-drying.

Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus；membrane；fatty acid；freeze-drying

Q93-33

A

1001-2230（2011）08-0004-04

2011-04-27

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助（CARS-37）。

李揚(yáng)（1986-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。

張列兵