膠原三肽對B16黑素瘤細胞黑素合成的影響

[摘要]目的：研究膠原三肽對B16黑素瘤細胞的影響，探討其美白作用與機制。方法：本文以B16黑素瘤細胞作為受試細胞，以濃度為10μg/ml曲酸作為陽性對照，研究膠原三肽對其增殖、細胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響。結(jié)果：膠原三肽濃度范圍為50～400μg/ml時對B16黑素瘤細胞增殖無明顯影響，但均能顯著抑制黑色素合成。且400μg/ml膠原三肽抑制酪氨酸酶活性具有極顯著性。結(jié)論：膠原三肽具有一定的美白功能。

[關(guān)鍵詞]膠原三肽；B16黑素瘤細胞；黑色素合成；酪氨酸酶活性；細胞增殖

[中圖分類號]739.5[文獻標識碼] [文章編號]1008-6455（2011）06-0939-03

Effect of collagen tripeptide on melanogenesis in B16 melanoma cells

CHENG Jing1， CHEN Dong-liang1，JIANG Xue-qiong2，CHEN Da-wei2，YANG Guo-yan1，TANG Liang-yan2，

WANG A-jing1

(1.Wuhan Peptide Substance Research Institute，Wuhan 430023，Hubei，China;2.Wuhan Hopsun Biological Product Inspection Co.，LTD)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of collagen tripeptide on B16 melanoma cells.MethodsThe cell proliferation， the tyrosinase activity and the melanin content were detected， using kojic acid as stnadard control.ResultsThe results showed there were no perceptible effect on B16 cell proliferation， but melanin was decreased significantly by the concentrations of collagen tripeptide from 50μg/ml to 400μg/ml. The tyrosinase activity was inhibited remarkably by 400μg/ml collagen tripeptide.ConclusionCollagen tripeptide could inhibit melanogenesis in B16 melanocytes obviously.

Key words: collagen tripeptide(CTP);B16 melanoma cells;melanogenesis;tyrosinase activity;cell proliferation

人類皮膚的顏色主要取決于黑色素的含量與分布，而黑色素細胞的結(jié)構(gòu)功能和數(shù)量直接影響皮膚中黑色素的含量。傳統(tǒng)的美白化妝品采用過氧化氫，氯化氨基汞以及各種酚類衍生物等能使黑色素組織迅速分解，但其對皮膚具有腐蝕性，細胞毒性和過敏性，目前許多國家已禁用此類物質(zhì)[1]。因此，尋找新的安全的美白產(chǎn)品是極為迫切的。

研究表明[2]，膠原肽具有安全性高、細胞粘結(jié)性好、透明、無臭和無刺激等特點，可作為化妝品原料。陳龍等[3]發(fā)現(xiàn)魚膠原肽具有抑制酪氨酸酶活性功能，且抑制能力遠高于市場上的同類產(chǎn)品。王靜鳳等[4]發(fā)現(xiàn)魷魚皮膠原蛋白多肽具有降低黑色素含量、抑制酪氨酸酶活性以及下調(diào)酪氨酸酶mRNA表達的功能。王奕等[5]發(fā)現(xiàn)日本刺參膠原肽具有促進B16細胞增殖，抑制黑色素合成和酪氨酸酶活性，下調(diào)酪氨酸酶mRNA表達的功能。

膠原三肽（collagen tripeptide CTP）是組成膠原的最小單位，其結(jié)構(gòu)可表示為﹝Gly-x-y﹞是一種N端帶有甘氨酸的高純度三肽。膠原三肽平均分子量約為280Da。研究發(fā)現(xiàn)，膠原三肽具有優(yōu)異的保濕效果和滲透性，同時還能夠促進膠原和透明質(zhì)酸的合成[6]。

本研究以膠原三肽為研究對象，探討其對B16黑素瘤細胞黑素合成，酪氨酸酶活性以及細胞增殖的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1小鼠B16黑素瘤細胞株：購于武漢博士德生物工程有限公司，于RPMI1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清，105U/L青霉素，105U/L鏈霉素）、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代一次。

1.1.2膠原三肽：由武漢天天好生物制品有限公司提供。

1.1.3主要藥品和儀器：RPMI1640培養(yǎng)液、胰酶、無菌PBS（武漢博士德生物工程有限公司），L-DOPA（sigma），MTT（sigma），脫氧膽酸鈉（分析純），DMSO（分析純），6孔板（武漢博士德生物工程有限公司），96孔板（武漢博士德生物工程有限公司），細胞培養(yǎng)瓶（武漢博士德生物工程有限公司），10ml具塞試管（武漢博士德生物工程有限公司），酶標儀（南京江南光學(xué)儀器廠），SW-CJ.2FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），XSP-15CZ倒置顯微鏡（上海長方光學(xué)儀器有限公司），CO2培養(yǎng)箱（Heraeus）。

1.2方法

1.2.1細胞增殖活性測定：取對數(shù)生長期的B16細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞濃度為4×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液200μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁24h后，棄培養(yǎng)液，曲酸對照處理組加入含有曲酸（濃度為10μg/ml）的完全培養(yǎng)液200μl，膠原三肽組加入含有膠原三肽（濃度分別為50μg/ml，200μg/ml，400μg/ml）的完全培養(yǎng)液200μl，空白組加入等量的完全培養(yǎng)基。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)72h。MTT法于酶標儀570nm處測定吸光度（A）值，以A值表示細胞增殖活性。

1.2.2酪氨酸酶活性測定：酪氨酸酶活性是根據(jù)多巴向多巴醌氧化的速度來確定。調(diào)整細胞濃度至5×105/ml，接種于6孔板，每孔2ml。膠原三肽組、曲酸對照處理組及空白組處理同1.2.1。每個處理重復(fù)6個孔。本研究參照Hideya Ando等[7]的方法，加入0.5%脫氧膽酸鈉溶液并充分震蕩使細胞破碎，以L-DOPA為反應(yīng)底物，475nm進行檢測。酪氨酸酶活性計算公式為：

酪氨酸酶活性=(A1－A2)/細胞數(shù)

注：0min的吸光度為A1，10min的吸光度為A2

1.2.3黑色素含量測定：調(diào)整細胞濃度至5×105/ml接種于6孔板，每孔2ml。膠原三肽組、曲酸對照處理組及空白組處理同1.2.1。每個處理重復(fù)6個孔。本研究參照Hideya Ando等[7]的方法，加入含有10%DMSO的1mol/L NaOH，超聲破碎30min，置于80℃水浴30min，470nm處測定吸光度（A）。黑色素含量計算公式為：

黑色素含量=A/細胞數(shù)

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計處理。

2結(jié)果與分析

2.1 細胞增殖活性測定：空白組，曲酸對照處理組及膠原三肽各處理組吸光度檢測值經(jīng)統(tǒng)計分析處理后無差異顯著性（P＞0.05）（如圖1所示），即空白組，曲酸對照組及膠原三肽各處理組細胞活性及細胞增殖程度無明顯差異。表明膠原三肽濃度范圍為50～400μg/ml時對B16黑素瘤細胞增殖無明顯影響。

2.2 酪氨酸酶活性測定：膠原三肽濃度為400μg/ml時，其酪氨酸酶活性與空白組酪氨酸酶活性差異具有極顯著性（P＜0.01）（如圖2所示）。曲酸對照處理組的酪氨酸酶活性與空白組酪氨酸酶活性差異具有極顯著性（P＜0.01）。但400μg/ml膠原三肽抑制酪氨酸酶活性與曲酸對照處理組抑制酪氨酸酶活性能力無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 黑色素含量測定：膠原三肽濃度為50～400μg/ml時均能顯著降低B16黑素瘤細胞中黑色素的含量，且濃度為50μg/ml時其黑色素含量與空白組黑色素含量具有差異極顯著性（P＜0.01）（如圖3所示）。曲酸對照處理組的黑色素含量與空白組黑色素含量亦呈現(xiàn)差異極顯著性（P＜0.01）。50μg/ml膠原三肽組黑色素含量低于曲酸對照組黑色素含量且差異具有顯著性（P＜0.05），即50μg/ml膠原三肽抑制黑色素合成的能力強于曲酸對照處理組。

3討論

正常情況下，決定皮膚顏色的主要原因有皮膚內(nèi)各種色素的含量和皮膚的厚度及光線在皮膚表面的散射現(xiàn)象，其中黑色素起主要作用[8]。而酪氨酸酶是黑素生成途徑中的主要限速酶。本研究結(jié)果表明400μg/ml膠原三肽處理組的酪氨酸酶活性與空白組相比具有差異極顯著性，其與曲酸對照處理組抑制酪氨酸酶活性能力相當。且抑制能力與膠原三肽濃度呈正比，這與陳龍等[2]的研究結(jié)果相似。濃度范圍為50～400μg/ml時膠原三肽均能顯著抑制B16黑素瘤細胞內(nèi)黑色素合成，且濃度為50μg/ml時其抑制能力最強，遠高于曲酸對照處理組。但濃度為50μg/ml的膠原三肽抑制酪氨酸酶活性的能力并不顯著，提示膠原三肽抑制黑色素合成可能與合成途徑中的多個酶有關(guān)，也可能通過其他途徑干預(yù)黑色素合成。濃度為50～400μg/ml膠原三肽其對B16黑素瘤細胞的增殖活性無明顯影響。

本實驗結(jié)果顯示膠原三肽對B16黑素瘤細胞增殖活性無明顯影響，但具有抑制B16黑素瘤細胞內(nèi)酪氨酸酶活性功能及抑制細胞內(nèi)黑色素合成的功能，表明膠原三肽具有一定的美白功能。其具體機制仍需進一步探索。

[參考文獻]

[1]王白強，曾曉軍.酪氨酸酶活性的抑制研究及皮膚美白化妝品的研制[J].福建輕紡，2002，7:1-6.

[2]丁卓平，劉振華，李仁冬，等.羅非魚魚皮膠原蛋白提取條件的研究[J].水產(chǎn)科技情報，2006，33（4）：190-192.

[3]陳龍，陳棟梁，楊國燕，等.魚膠原肽抑制酪氨酸酶酶活性能力的比較研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2008，10：1512-1514.

[4]王靜鳳，王奕，崔鳳霞，等.魷魚皮膠原蛋白多肽對B16黑素瘤細胞黑素合成的影響[J].營養(yǎng)學(xué)報，2007，23(9):1181-1184.

[5]王奕，王靜鳳，張瑾，等.日本刺參膠原肽對B16黑素瘤細胞黑素合成的影響[J].營養(yǎng)學(xué)報，2007，29（4）：401-404.

[6]摘譯自：膠原水解物的皮膚滲透性及生物功能性[J].日本寫真學(xué)會志.2004，67（4）：397-401；繆進康.譯.明膠科學(xué)與技術(shù)，2006，26（1）：33-39.

[7]Hideya Ando，Akira Itoh，Yutaka Mishima，et al. Correlation between the number of melanosome，tyrosinase mRNAlevels，and tyrosinase activity in cultured murine melanoma cells in response to various melanogenesis regulatory agents[J].J Cell Physiol，1995，163：608-614.

[8]張學(xué)軍.現(xiàn)代皮膚病理學(xué)基礎(chǔ)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:87-88.

[收稿日期]2011-03-10[修回日期]2011-05-23

編輯/張惠娟

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