硒化殼聚糖促表皮細(xì)胞增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：研究硒化殼聚糖對(duì)體外培養(yǎng)表皮細(xì)胞增殖的影響。方法：用不同劑量（25、50、100、200、400mg/L）硒化殼聚糖作用于表皮細(xì)胞，電鏡觀察藥物對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響； 3H－TdR摻入法、LDH漏出率用于檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖及損傷的影響，并以等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液處理為對(duì)照組。結(jié)果：各藥物濃度作用細(xì)胞后，細(xì)胞核均有不同程度的增大，核漿比增大，核仁變大，變多，擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，細(xì)胞表面突起增加，線粒體更為豐富，更易見到聚集成團(tuán)的糖原等現(xiàn)象；硒化殼聚糖可促進(jìn)表皮細(xì)胞對(duì)3H－TdR的吸收(P<0.05，P<0.01)，降低LDH漏出率(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：硒化殼聚糖能促進(jìn)體外培養(yǎng)表皮細(xì)胞增殖。

[關(guān)鍵詞]硒化殼聚糖;表皮細(xì)胞；增殖

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2011）06-0941-03

The promoting proliferation effect of selenium chitosan on the epidermal cell cultured in vitro

DENG Shou-heng1，WU Fang-yi2，KE Xian-zhu3， REN Ni-li1， CHEN Ping1，CHEN Wen4

(1.Center of Oncology，People's Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000，Hubei，China; 2.Department of Dermatology， People's Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000， Hubei， China; 3.Department of Orthopedics，People's Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000，Hubei，China;4. Department of Orthopedics， Taihe Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000，Hubei，China)

Abstract: ObjectiveTo study the effects of selenium chitosan on the proliferation of culturedEpidermal cell in vitro.MethodsThe culturedEpidermal cell were treated with selenium chitosan at concentrations of 25、50、100、200、400 mg/Land the equal volume of media as control group.the ultrastructures of Epidermal cell were studied under electron microscope; the effect on cell proliferation was measured by 3H－TdR infiltration and the damage to cell was measured by the leakage rate of LDH.ResultsThe electron microscope showed that in the test group the nucleus endoplasmic reticulum mitochondrion glycogen and the ratio of nucleus to cytoplasm increased or became bigger in a concentration dependence manner. Compared with control group， selenium chitosan could enhance the absorption to3H-TdR (P<0.05， P<0.01)and decrease the leakage rate of LDH (P<0.05， P<0.01).ConclusionSelenium chitosan could promote the proliferation of Epidermal cell cultured in vitro.

Key words: selenium chitosan; Epidermal cell; proliferation

殼聚糖[1]是來自海洋生物的多糖，因其生物相容性良好，幾乎無毒性和不良反應(yīng)，在現(xiàn)代藥物制備中常作為良好的藥物材料進(jìn)行開發(fā)。硒是一種具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種功效的微量元素，自然界中的硒多為無機(jī)硒，存在著不易被細(xì)胞吸收，劑量不易控制等缺點(diǎn)。硒化殼聚糖[2]是將殼聚糖與亞硒酸通過拼合原理制備成的有機(jī)硒，可有效克服無機(jī)硒的上述缺點(diǎn)。創(chuàng)傷是最常見的損傷，有報(bào)道稱創(chuàng)傷后的局部皮膚組織和血尿等體液中存在著硒的缺乏[3-4]，而補(bǔ)硒則能明顯促進(jìn)參與深部創(chuàng)面修復(fù)的主要細(xì)胞皮膚成纖維細(xì)胞的增殖[5]，補(bǔ)硒對(duì)參與淺部損傷修復(fù)的表皮細(xì)胞影響如何，本文對(duì)此進(jìn)行了報(bào)道。

1材料和方法

1.1 藥品試劑與儀器：硒化殼聚糖由福建醫(yī)科大學(xué)藥化系合成； DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶及小牛、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；乳酸脫氫酶（LDH）購(gòu)自Sigma公司；3H－脫氧胸腺嘧啶核苷酸（3H－TdR）購(gòu)自北京中國(guó)原子能研究所。Hu12A型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；BeckmanLX20全自動(dòng)生化測(cè)定儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；LS3801型液閃計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將術(shù)中取下的包皮（患者知情同意）在無菌條件下漂洗，去除皮下組織，剪成1mm×1 mm×1 mm組織塊，培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換1次液。待長(zhǎng)成致密單層后，用濃度為2.5g/L的胰酶消化，按體積比為6傳代，將第6代細(xì)胞用作實(shí)驗(yàn)，根據(jù)硒化殼聚糖濃度不同分為空白對(duì)照組、25、50、100、200、400 mg/L組共6組。

1.2.2 電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化[6]： 取第6代細(xì)胞，5×103個(gè)/ml接種于24孔板，每孔0.5ml，培養(yǎng)24h后加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)48h，0.5%胰酶消化后移入錐形管中，離心收集細(xì)胞，電鏡下觀察。

1.2.3 3H－TdR摻入法測(cè)定DNA合成：取第6代細(xì)胞， 5×103個(gè)/ml接種于96孔板，每孔接種100μl，培養(yǎng)48h，按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入3H－TdR37MBq/L，繼續(xù)培養(yǎng)24h后用0.25%胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移至玻璃纖維濾紙上，依次用生理鹽水、10%三氯醋酸、無水乙醇沖洗固定干燥后加閃爍液，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘閃爍次數(shù)值（count per minute，CPM）。

1.2.4 LDH漏出率的測(cè)定：取第6代細(xì)胞， 5×103個(gè)/ml接種于96孔板，每孔接種100μl，培養(yǎng)48h， 按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng)24h，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)上清液中LDH的含量，將培養(yǎng)板中的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，超聲波粉碎后加入PBS液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH的含量，LDH漏出率的計(jì)算公式[7]：

漏出率＝（LDH上清液－LDH胞內(nèi)）/ LDH胞內(nèi)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均以x±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1電鏡下觀察結(jié)果：透射電鏡下空白組的細(xì)胞核仁可見，多為單個(gè)，少量細(xì)胞也可見多個(gè)核仁， 細(xì)胞表面可見微絨毛。各濃度硒化殼聚糖組細(xì)胞表面微絨毛豐富，核大，扭曲明顯，有深凹陷，核內(nèi)異染色質(zhì)稍多，呈小斑塊狀散在分布于核基質(zhì)中，核仁大，常多個(gè)（2～3個(gè)）有時(shí)可達(dá)4個(gè)，有少數(shù)細(xì)胞體積明顯增大，部分細(xì)胞內(nèi)見多個(gè)核切面。細(xì)胞漿內(nèi)糖原豐富，有線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有些高爾基體也較發(fā)達(dá)，細(xì)胞多處于分裂期。見圖1。

2.2硒化殼聚糖對(duì)表皮細(xì)胞LDH漏出率和DNA合成的影響: 硒化殼聚糖可降低表皮細(xì)胞LDH漏出率，藥物濃度越大漏出率降低越明顯，呈劑量依賴趨勢(shì)，當(dāng)藥物濃度為100mg/L及以上時(shí)，對(duì)LDH漏出率的影響與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05， P<0.01)。各濃度硒化殼聚糖均可促進(jìn)表皮細(xì)胞對(duì)3H－TdR的攝入， 25mg/L組cpm值即大于空白對(duì)照組（P<0.05），200、400mg/L組cpm值遠(yuǎn)大于空白對(duì)照組（P<0.01）。見表1。

3討論

3.1 創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜有序的過程，深度損傷的修復(fù)主要通過肉芽組織的生成來實(shí)現(xiàn)，淺表?yè)p傷修復(fù)則主要通過上皮細(xì)胞的增殖、遷移來完成。創(chuàng)面愈合包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、創(chuàng)面成熟和重建三個(gè)階段，炎癥反應(yīng)啟動(dòng)并全程參與了創(chuàng)面修復(fù)過程，硒化殼聚糖主要是由具有抗炎等活性的硒和殼聚糖合成，理應(yīng)會(huì)對(duì)創(chuàng)面愈合過程產(chǎn)生影響，而前期的研究也證實(shí)了其能通過影響一氧化氮和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌促進(jìn)肉芽組織中主要細(xì)胞皮膚成纖維細(xì)胞增殖和膠原的合成[8-9]。

3.2 本文中，筆者在電鏡下觀察了經(jīng)硒化殼聚糖處理后的表皮細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)各超微結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)出增殖旺盛的特征，濃度越高，增殖旺盛特征越明顯。細(xì)胞生物學(xué)研究表明，分裂旺盛的細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞核變大、核仁增多、增大、細(xì)胞表面突起增多等特征。糖原是細(xì)胞合成、分泌、代謝等生物學(xué)活動(dòng)的能量來源，糖原增多可間接提示細(xì)胞代謝旺盛；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體共同形成的一個(gè)復(fù)合機(jī)能單位，是細(xì)胞進(jìn)行生物合成的重要基地，其發(fā)達(dá)程度可作為判斷細(xì)胞分化和功能狀態(tài)的指標(biāo)，細(xì)胞合成代謝活躍或分泌活動(dòng)旺盛時(shí)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目增多，功能相對(duì)減弱時(shí)則數(shù)目減少。為進(jìn)一步驗(yàn)證硒化殼聚糖對(duì)表皮細(xì)胞的促增殖作用，筆者又采用了3H－TdR摻入法進(jìn)行檢測(cè)，脫氧胸腺嘧啶核苷酸（TdR）是合成DNA的原料之一，細(xì)胞增殖旺盛則DNA合成加快，細(xì)胞對(duì)TdR的需求量增加。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)硒化殼聚糖作用后表皮細(xì)胞對(duì)3H－TdR摻入量明顯增強(qiáng)，促進(jìn)了表皮細(xì)胞DNA的合成和增殖，與電鏡下觀察結(jié)果一致。

3.3 LDH是存在于細(xì)胞漿內(nèi)參與糖酵解反應(yīng)的酶，進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，如果培養(yǎng)的細(xì)胞受損，LDH會(huì)由細(xì)胞漏出至培養(yǎng)液中，通過測(cè)定培養(yǎng)液中LDH水平可衡量細(xì)胞受損的程度，間接反映藥物的安全性[10]。本實(shí)驗(yàn)中硒化殼聚糖非但沒有增加，相反卻能降低LDH漏出率，說明硒化殼聚糖對(duì)表皮細(xì)胞尚有一定的保護(hù)作用，這與在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中并未見到有顯著的空泡增多、細(xì)胞溶解等細(xì)胞損害現(xiàn)象相一致。

硒化殼聚糖可促過參與深部損傷修復(fù)的主要細(xì)胞皮膚成纖維細(xì)胞增殖，也能明顯促進(jìn)參與淺表?yè)p傷修復(fù)的表皮細(xì)胞增殖，提示硒化殼聚糖具有良好的促創(chuàng)面愈合的藥理作用，其作用機(jī)制及作用劑型值得進(jìn)一步深入研究和開發(fā)。

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[收稿日期]2011-03-29 [修回日期]2011-05-16

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、公式、注解等請(qǐng)以PDF格式閱讀”