脂肪組織工程研究進(jìn)展

成功構(gòu)建組織工程化脂肪的關(guān)鍵在于：①種子細(xì)胞的選定和獲取；②具有良好生物降解性和組織相容性的三維支架材料；③種子細(xì)胞增殖和分化的微環(huán)境。本文就這三方面的研究進(jìn)展綜述如下：

1種子細(xì)胞的選定和獲取

選擇一種適宜的種子細(xì)胞是成功構(gòu)建組織工程脂肪的前提。干細(xì)胞是一類未分化、保持多種分化潛能且長(zhǎng)期生存的細(xì)胞群。干細(xì)胞按其分化階段的不同，可以分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞兩類。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）具有多向分化潛能、長(zhǎng)期未分化增殖能力和種系傳遞功能，但其來源不足、體外培養(yǎng)困難、定向誘導(dǎo)存在許多技術(shù)問題，用于臨床存在免疫排斥、致瘤性和倫理學(xué)問題，故限制了臨床應(yīng)用[1]。成體干細(xì)胞來源豐富，取材方便，易實(shí)現(xiàn)自體取材，可克服宿主免疫排斥反應(yīng)，故成體干細(xì)胞的研究很廣泛[2]。成體干細(xì)胞的研究主要集中在間充質(zhì)干細(xì)胞，它可來源于各種組織，包括：骨髓、脂肪、肝、脾、胰腺、睪丸、月經(jīng)血、真皮、牙髓，甚至肺等[3]。其中主要代表是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。它們可通過冷凍、干燥、冷凍干燥等三種方法存儲(chǔ)[4]。

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）:BMSCs是來源于骨髓間充質(zhì)的成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有較強(qiáng)的自我增殖能力和多分化潛能，可分化骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、肌腱細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[5-6]。它的表面標(biāo)記分子已明確，并已用于細(xì)胞篩選及計(jì)數(shù)。分離、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法有：全骨髓法、密度梯度離心法、免疫學(xué)分離法、貼壁篩選法、密度梯度離心與貼壁篩選相結(jié)合?，F(xiàn)已證明密度梯度離心與貼壁篩選相結(jié)合，通過首次換液后頻繁更換新鮮培養(yǎng)液和傳代時(shí)縮短胰蛋白酶消化時(shí)間的方法，可得到純度和分化能力均比對(duì)照組高的BMSCs細(xì)胞群。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是自骨髓移植供者骨髓獲得，這種方法難免會(huì)給供者帶來痛苦，同時(shí)還可能導(dǎo)致供區(qū)并發(fā)癥。骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞含量極低，而且增殖與分化能力還受年齡的影響，年齡越大，其增殖分化能力也逐漸下降。這些因素限制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。

1.2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipos-derived mesenchymal stem cells，ADSCs):前脂肪細(xì)胞是脂肪細(xì)胞的前體細(xì)胞，可向成熟脂肪細(xì)胞分化。前脂肪細(xì)胞因子1(Pref-1)是一種前脂肪細(xì)胞特殊標(biāo)志的跨膜蛋白，該蛋白隨著前脂肪細(xì)胞的分化而消失，因此前脂肪細(xì)胞因子1是前脂肪細(xì)胞的重要標(biāo)記物[7]。前脂肪細(xì)胞的特點(diǎn)在于：能自發(fā)地分化成脂肪細(xì)胞，不會(huì)分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞等。但是前脂肪細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)幾代后，就失去了分化能力，不能為脂肪工程生成足量脂肪細(xì)胞。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是一種存在于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的潛能，可分化成成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、生肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞[8]、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞譜系。脂肪干細(xì)胞可以在任何白色脂肪組織中找到，包括皮下脂肪和網(wǎng)膜脂肪。通過脂肪抽吸術(shù)或脂肪切除術(shù)可獲得大量的脂肪干細(xì)胞群。在脂肪組織中，每克組織含5000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞；常規(guī)脂肪抽取液300ml可獲得在1×107和6×108之間不等的干細(xì)胞，并且90%以上的細(xì)胞具有活力，因此脂肪組織具有高密度的干細(xì)胞[9]。干細(xì)胞可通過膠原酶消化、反復(fù)過濾、離心而獲得SVF，然后傳代純化。取材需考慮性別、年齡、取材位置，這些因素會(huì)影響細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，從而影響到干細(xì)胞的增殖和分化[10]。與BMSCs相比，ADSCs在成脂分化培養(yǎng)下生長(zhǎng)更快，活力更強(qiáng)[11]；而且培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)衰老的時(shí)間更晚。目前ADSCs的特異性表面標(biāo)記物尚不明確，只了解到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD49e、CD54、CD55、CD63、CD73、CD90、CD105、CD144、CD146、CD166，它不表達(dá)CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、STRO-1、CD3、CD117、CD62L、CD95L [12-13]。

1.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchym al stem cells，hUCMSCs):hUCMSCs是存在于華氏膠中的一種具有自我更新、增殖和多向分化潛能的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。它與ADSCs、BMSCs和ESCs相比，具有以下優(yōu)勢(shì)：來源豐富，成本低，不涉及倫理問題，不會(huì)給捐獻(xiàn)者帶來傷害，表達(dá)胚胎干細(xì)胞某些特異標(biāo)志等。hUCMSCs分離方法主要有：酶消化法、組織塊貼壁法。在酶消化法中，由于臍帶是富含葡萄糖胺和膠原的組織，故多用透明質(zhì)酸酶和膠原酶消化以獲得hUCMSCs[14]。hUCMSCs在體外被證實(shí)可向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、生殖細(xì)胞等方向分化。hUCMSC高表達(dá)CD73、CD90、CD105、CD54、CD13、CD29、CD44，不表達(dá)CD34、CD45、CD14、CD33、CD13。

2支架材料

3T3-L1前脂肪細(xì)胞只有培養(yǎng)在三維環(huán)境下才能維持正常的細(xì)胞形態(tài)和功能，因此，尋找一個(gè)合適的生物支架材料是組織工程的關(guān)鍵。理想的支架材料需具備良好的生物相容性、良好的生物降解性、三維立體多孔結(jié)構(gòu)及良好的細(xì)胞界面。目前已經(jīng)有大量人工合成或天然來源材料被應(yīng)用到脂肪組織工程中。合成支架的優(yōu)點(diǎn)在于統(tǒng)一控制的條件下生產(chǎn)，可根據(jù)具體需要修改其化學(xué)和物理特性；天然材料的優(yōu)點(diǎn)在于異物反應(yīng)少。天然材料主要有：蠶絲、透明質(zhì)酸、甲殼素、膠原和纖維蛋白等；人工合成的主要有：聚四氟乙烯、聚乙烯醉、聚乳酸（PLA）、聚乙酸醇（PGA）和聚乳酸-聚乙酸醇酸（PLGA）等。常用的主要有膠原支架、HYAFF11海綿支架(透明質(zhì)酸衍生酯)、聚乳酸一聚乙醇酸共聚物支架等。

2.1 人工合成材料

2.1.1 PLGA:PGA和PLA具有可降解性、生物相容性、表面活動(dòng)度，被廣泛運(yùn)用于支架材料。PLGA（PGA和PLA的復(fù)合物）具有促進(jìn)種子細(xì)胞的粘附、增殖、分化的特性，近年來研究比較廣泛。PLGA是通過孔隙間全連通的三維細(xì)胞支架，其自催化降解行為被明顯抑制，支架的外觀尺寸和孔隙率穩(wěn)定，有利于獲得外觀尺寸穩(wěn)定的工程化組織。但是，PLGA是通過水解酯鍵降解，降解產(chǎn)物乳酸和乙醇酸會(huì)降低周圍微環(huán)境的pH值，從而影響組織和細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)[15]。另外，該材料較硬，給患者帶來不舒服，其來源主要靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴。這些因素在某種程度上限制PLGA在脂肪組織工程中的應(yīng)用。近幾年，研究人員通過溶劑蒸發(fā)技術(shù)在PLGA中加入三磷酸鈉（TPP），不僅能降低pH，而且能促進(jìn)干細(xì)胞在該支架上增殖，該技術(shù)將更促進(jìn)PLGA的臨床應(yīng)用[15]。

2.1.2 HYAFF:透明質(zhì)酸在組織工程領(lǐng)域占有很重要的地位。它存在于結(jié)締組織、關(guān)節(jié)滑液和眼睛玻璃體中。在很多生物過程中起著重要作用，如組織水合作用、細(xì)胞分化、細(xì)胞行為和組織修復(fù)。HYAFF 是通過透明質(zhì)酸和苯甲醇酯化形成的。HYAFF具有良好生物相容性、完全可降解性、水穩(wěn)定性等特性，是一種很有潛力的支架材料，它可以加工生產(chǎn)出很多生物相容性好的材料，比如導(dǎo)管、膜、紗布、海綿等[16]。人肝細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞已成功地在這些模型進(jìn)行培養(yǎng)。海綿支架作為構(gòu)建組織工程脂肪的支架，具有免疫原性較低，可促進(jìn)細(xì)胞一支架復(fù)合物血管形成等優(yōu)點(diǎn)，但其最大缺點(diǎn)則為它不利于前脂肪細(xì)胞的分化成熟，故也限制了其在脂肪組織工程研究中的應(yīng)用。

2.2 天然來源材料

2.2.1 膠原：膠原不僅可以做組織支持物，而且是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，它表現(xiàn)很好的細(xì)胞親合力。Itoi等[17]發(fā)現(xiàn)型膠原海綿與PLGA和透明質(zhì)酸凝膠相比，它是最適合做脂肪組織工程的支架材料。但是由于它具有免疫原性、機(jī)械性能差、易于變形、花費(fèi)高，所以難以獨(dú)立構(gòu)成三維支架。

2.2.2 蠶絲:蠶絲作為一個(gè)天然高分子，有較好的機(jī)械性能和良好的生物相容性[18]。蠶絲是由絲素蛋白（約75%以上）和絲膠蛋白（約25%）構(gòu)成[19]?？赏ㄟ^化學(xué)和物理方法，去除絲膠蛋白成分，從而達(dá)到調(diào)整蠶絲的機(jī)械強(qiáng)度。絲素蛋白具有良好的生物相容性，手術(shù)縫合線可證明它的性能。3T3-L1前脂肪細(xì)胞能在蠶絲支架上很好地吸附，并表現(xiàn)出正常的形態(tài)和功能。劉毅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，50 um為構(gòu)建組織工程脂肪時(shí)蠶絲蛋白支架材料的最佳孔徑。

2.3 微粒球:支架的形狀決定了再生組織的應(yīng)用，從而孕育了可注射微球的理念。前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞以凝膠的形式注入，由于缺少足夠的細(xì)胞粘附面積導(dǎo)致注入受限。針對(duì)以上原因，Burg等[21]發(fā)明了被水凝膠包裹的微粒球，可以被注入，脂肪細(xì)胞最終得到生長(zhǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校⒘Ｇ蚝湍z的聯(lián)合適合脂肪組織再生，微粒球的不同構(gòu)成會(huì)影響細(xì)胞粘附、基因表達(dá)、前脂肪細(xì)胞脂滴的形成。Masude等[22]利用含有豐富的血管和脂肪組織的網(wǎng)膜的碎裂組織包裹前脂肪細(xì)胞并植入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)前脂肪細(xì)胞能在種植處產(chǎn)生脂肪組織。促進(jìn)脂肪再生的另一種完全不同的方式是通過注入前脂肪細(xì)胞和細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞遷移到靶目標(biāo)后增殖再生脂肪組織。在小鼠基底膜注入前脂肪細(xì)胞和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，注射部位的脂肪墊可觀察到脂肪再生。這種再生脂肪很可能是前脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞遷移造成的，該方法仍有待進(jìn)一步的研究[23]。

3微環(huán)境

細(xì)胞能在體內(nèi)生長(zhǎng)增殖，是由各種細(xì)胞因子和氧濃度調(diào)節(jié)完成的，因此兩者均很重要。

3.1細(xì)胞因子:運(yùn)用足量的生長(zhǎng)因子可促進(jìn)組織工程化脂肪的形成，應(yīng)用生長(zhǎng)因子的類型分體內(nèi)與體外兩種。體外培養(yǎng)中，應(yīng)用一些生長(zhǎng)因子是極有必要的，因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素、胰島素、胰島素增敏劑[24]、三異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、Asc-2-P、bFGF-2等生長(zhǎng)因子能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化。體內(nèi)應(yīng)用具有可選性，可能會(huì)加速組織工程化脂肪的形成。

組織工程化脂肪移植到受者體內(nèi)，早期處于缺血狀態(tài)，待新生血管形成后，才能建立血液循環(huán)。故研究在組織工程中加入與血管生成相關(guān)的生長(zhǎng)因子，可以增強(qiáng)組織工程化脂肪的血管化，加速血液循環(huán)的建立，減少脂肪細(xì)胞的壞死和吸收。這些因子主要有：血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、血管生成素-1（Ang-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等。VEGF 和Ang-1分別對(duì)血管生成的不同時(shí)期起作用，并且形成的血管紊亂，不穩(wěn)定[25]。VEGF 和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1共同作用能形成比較穩(wěn)定的血管結(jié)構(gòu)[26]；PDGF、TGF-β和Ang-1均起穩(wěn)定血管的重要作用。純化的血管生成相關(guān)因子因體內(nèi)半衰期短，不能起到理想效果，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可使他們有效而持續(xù)地表達(dá)。但如果不嚴(yán)格控制每個(gè)細(xì)胞周圍的微環(huán)境，就有可能誘導(dǎo)異常血管及血管瘤的產(chǎn)生。為了使該技術(shù)得到臨床運(yùn)用，研究人員發(fā)明了一種以流式細(xì)胞分流儀為基礎(chǔ)的高通量方法來確定轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的表達(dá)水平，從而快速去除異常細(xì)胞，純化正常表達(dá)的細(xì)胞[27]。該技術(shù)成功地使轉(zhuǎn)有VEGF的成肌細(xì)胞在體內(nèi)骨骼肌里形成豐富的血管網(wǎng)，避免異常血管的產(chǎn)生。細(xì)胞和基因治療相結(jié)合法為組織工程的高效植入提供了一個(gè)新的思路。Lin等[28]成功轉(zhuǎn)導(dǎo)Pdx1基因到ADSC，得到穩(wěn)定產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。研究表明：轉(zhuǎn)染VEGF165基因的ASCs能夠大量、穩(wěn)定且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間分泌VEGF，能為血管形成提供豐富穩(wěn)定的血管生成因子，有促進(jìn)工程化脂肪組織的血管化的作用，具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能，參與血管形成，使得內(nèi)皮細(xì)胞需要的數(shù)量相對(duì)減少，脂肪組織工程在臨床上應(yīng)用的可能性增加。

3.2氧分壓:研究人員30年前就開始研究造血系統(tǒng)中氧分壓對(duì)干細(xì)胞的生理影響。實(shí)驗(yàn)研究中體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的氧濃度大多數(shù)在20%左右，然而天然的內(nèi)環(huán)境細(xì)胞的氧濃度往往要低很多：如動(dòng)脈平均氧分壓為12%[29]。檢驗(yàn)一位志愿者的骨髓抽取液時(shí)，發(fā)現(xiàn)樣本處于低氧狀態(tài)，濃度大約在1%～2%[30]。盡管脂肪組織血管豐富，但是在小鼠體內(nèi)的脂肪細(xì)胞氧濃度只有3%左右[31]。故成人脂肪干細(xì)胞同樣處于低濃度氧狀態(tài)。最直接的證據(jù)可以來源于造血干細(xì)胞，它與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞處于同一微環(huán)境當(dāng)中[32]。有研究表明：低濃度氧的骨髓間充質(zhì)增殖數(shù)目是正常氧濃度的30倍[33]；胚胎干細(xì)胞能在低氧下保持未分化狀態(tài)長(zhǎng)達(dá)4周，保持其全能性長(zhǎng)達(dá)18個(gè)月[34]；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在氧濃度2%培養(yǎng)下，持續(xù)表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志OCT-4長(zhǎng)達(dá)6周[35]。所以，低濃度氧可以增強(qiáng)多種干細(xì)胞及祖細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)抑制分化，維持其多能性。Valorani等[36]研究發(fā)現(xiàn)鼠的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧下培養(yǎng)，Sca-1/CD44表達(dá)增加，增殖數(shù)量增加，分化潛能被抑制，轉(zhuǎn)移到正常氧濃度培養(yǎng)，成脂分化能力明顯增強(qiáng)。亦有研究表明低氧濃度對(duì)分化成其他特定的細(xì)胞株有積極作用，尤其是軟骨細(xì)胞和心肌細(xì)胞[37]。Fink等[38]認(rèn)為1%氧濃度能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，無脂肪特定的基因表達(dá)增加；然而Lee等[39]認(rèn)為2%氧濃度能抑制脂肪干細(xì)胞的成脂分化。促進(jìn)干細(xì)胞分化與保持其多能性的最適宜氧濃度至今尚未知。低氧還可通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)因子分泌水平，從而影響工程化脂肪的血管化。在低氧的刺激下，成人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的VEGF增加5倍[40]。一些體外研究也證明了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧期間均有VEGF表達(dá)的上調(diào)。

4脂肪組織工程的臨床應(yīng)用和展望

研究者們不斷采取多種有效方法使脂肪組織工程有了很大發(fā)展，如建立3D支架結(jié)構(gòu)，各種支架材料最適孔徑，轉(zhuǎn)導(dǎo)血管生長(zhǎng)因子，制造血管類似物，尋求和制造新的生物聚合物材料，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)及不斷更換培養(yǎng)基等。要讓組織工程化的脂肪組織更好地應(yīng)用于臨床，需移植物有很好的血管化，才能保證形態(tài)和功能的維持。細(xì)胞歸巢技術(shù)可誘導(dǎo)相關(guān)干細(xì)胞向特定的生理解剖位置轉(zhuǎn)移，增殖和分化脂肪組織，彌補(bǔ)壞死吸收的損失。隨著科學(xué)的發(fā)展，各種知識(shí)的升華，必將把上述問題予以解決，相信組織工程化脂肪最終將廣泛應(yīng)用于臨床，為軟組織修復(fù)帶來更好的明天。

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[收稿日期]2011-04-20 [修回日期]2011-05-31

編輯/李陽利