rhBMP2作用下人牙周膜成纖維細(xì)胞中cbfα1的表達(dá)研究

[摘要]目的：本實(shí)驗(yàn)通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，測(cè)定不同濃度的重組人骨形成蛋白2（rhBMP2）對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞中cbfα1mRNA在不同作用時(shí)間點(diǎn)表達(dá)，了解rhBMP2對(duì)骨改建過程的調(diào)控。方法：原代培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞，取生長(zhǎng)良好的第6代細(xì)胞，分別用25ng/ml、50ng/ml及100ng/ml的rhBMP2作用于細(xì)胞，于作用1、3、5、7天后收集細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)各組細(xì)胞4個(gè)時(shí)間作用點(diǎn)cbfα1 mRNA含量，PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳后，采用Image Pro Plus5.0圖像分析軟件對(duì)電泳膠帶亮度進(jìn)行分析。結(jié)果：不同濃度rhBMP2對(duì)cbfα1mRNA的表達(dá)均表現(xiàn)為初期降低，而后明顯增高，至峰值后回落。不同濃度對(duì)cbfα1 mRNA表達(dá)上調(diào)的峰值沒有明顯差異。100ng/ml和50ng/ml的rhBMP2濃度組能夠較快地上調(diào)cbfα1mRNA表達(dá)至峰值，然后100ng/ml組表現(xiàn)為緩慢下降，50ng/ml組迅速回落；25ng/ml組較慢上調(diào)cbfα1mRNA的表達(dá)至峰值后，迅速回落。結(jié)論：①根據(jù)實(shí)驗(yàn)各組中cbfα1的表達(dá)變化，提示筆者BMP2可以上調(diào)HPDLfs中cbfα1的轉(zhuǎn)錄水平，并且對(duì)cbfα1的表達(dá)調(diào)控主要為啟動(dòng)作用，cbfα1的表達(dá)增高幅度似乎與rhBMP2濃度并不相關(guān)。②高濃度組對(duì)cbfα1的上調(diào)作用迅速而持久，低濃度組的作用則相對(duì)遲緩而短暫。提示筆者BMP2可能通過上調(diào)cbfα1的表達(dá)而促進(jìn)HPDLfs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

[關(guān)鍵詞]牙周膜成纖維細(xì)胞；rhBMP2；cbfα1

[中圖分類號(hào)]R783 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2001）06-0965-04

Study on the expression variety of cbfα1 in human periodontal ligament fibroblasts with rhBMP2 reaction

JI Ling-ling1，ZHOU Hong1，LI Ang2，RAO Guo-zhou2

(1.Department of Orthodontics，Stomatological Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi，China;2.Medicine Research Center ofStomatology，Xi'an Jiaotong University)

Abstract:ObjectiveBy RT-PCR to investigating the effects of rhBMPs in different concentration on the expression of cbfα1 in human periodontal ligament fibroblasts.To clarify the molecular mechanism of BMPs' regulation to the HPDLfs，which contribute to the bone rebuilding. Methods The 6th generation well-grown primary culture fibrocyte from HPDLfs were used in the experiment.The cells were subjected to different doses ofrhBMP2(25ng/ml，50ng/ml and 100ng/ml) for 1，3，5，7 days in this experiment.mRNA expression of cbfα1 were determined by semiquantitative RT-PCR approach.electrophoresis tape brightness was analyzed by graphical analysis software Image Pro Plus5.0.Results The expression of cbfα1mRNA acted by each rhBMP2 of different concentration fell down in primary stage，then increased obviously and decreased after reaching the peak value.The peak value of expression which reacted in different concentration presented no significant difference. When the expression of cbfα1mRNA regulated rapidly to peak value in both concentration 50ng/ml and 100ng/ml，the expression decreased smoothly in 100ng/ml，but decreased sharply in 50ng/ml.The expression increased smoothly and decreased sharply in 25ng/ml at the same time. Conclusion ① Based on the different expression variety of cbfα1 in experiments，the results showed that BMPs can enhance the mRNA of cbfα1 in HPDLfs and acted mainly as startup effect on the expression regulation of cbfα1. The enhanced amplitude of cbfα1 expression seemed to be no relation with the rhBMP2 concentration.②. The enhancive effect in high concentration on cbfα1 was quick and abiding，but it was slow and unabiding in low concentration.

Key words:human periodontal ligament fibroblasts;rhBMP2;cbfα1

牙齒受力后牙周膜成纖維細(xì)胞是最先接受該機(jī)械信號(hào)的細(xì)胞，通過一系列信號(hào)傳導(dǎo)誘發(fā)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等一系列細(xì)胞的分化，引起牙周組織改建，牙齒得以移動(dòng)。而BMPs是這一型號(hào)通路中的重要細(xì)胞因子，可以促進(jìn)HPDLfs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化并參與組織改建[1]。核心結(jié)合因子（cbfα1）是近年來發(fā)現(xiàn)的未分化間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，一些研究表明其可能參與了正畸牙齒移動(dòng)過程中的牙周組織改建[2]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度重組人骨形成蛋2（rhBMP2）不同作用時(shí)間下HPDLfs中cbfα1mRNA表達(dá)的變化，探討B(tài)MPs促進(jìn)HPDLfs成骨分化的可能分子機(jī)制，以及與cbfα1的關(guān)系。

1材料和方法

1.1 主要試劑及儀器：Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶（Gibco公司），ABC免疫組化試劑盒（Vector，USA波形絲蛋白抗體，角蛋白抗體，rhBMP2（第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室），總RNA提取試劑盒TRIzol Reagent（Invitrogen公司），紫外分光光度計(jì)（Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro），反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase (200Uμl)（Promega公司），反轉(zhuǎn)錄緩沖液M-MLV RT 5××Reaction Buffer （Promega公司），DNTP(10mM)天為時(shí)代，DNA MARKERⅢ（天為時(shí)代）。

1.2 HPDLfs的體外培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組：①取材：取11～14歲因正畸矯治需要而拔除的健康年輕恒牙，采用組織塊消化培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。②無菌處理：在超凈臺(tái)內(nèi)用含雙抗的PBS從牙齒根方向冠方?jīng)_洗牙齒數(shù)次，用無菌手術(shù)刀片刮取牙根中部1/3處的牙周膜組織。③收集消化：將刮下的牙周膜組織置于PBS液中，移入離心管，離心（800r/6min），收集牙周膜組織，加入10倍體積的濃度為2%的Ⅰ膠原酶，置于CO2孵箱消化。④接種：約2h后，組織呈絮狀后，離心后收集組織，棄去膠原酶，加入含10%小牛血清（FCS），100μ/ml青霉素，100μ/ml鏈霉素的DMEM（低糖）培養(yǎng)液，充分吹打細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板。接種量為每孔接種1顆牙齒的牙周組織量。⑤孵育：置于CO2孵箱，37℃培養(yǎng)。3天內(nèi)保持培養(yǎng)板靜置，以利于組織貼壁。最早于第3天可見有細(xì)胞從組織塊中游出。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到孔板的30%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞分散后，繼續(xù)培養(yǎng)，期間常規(guī)換液。⑥傳代：待細(xì)胞覆蓋孔板底達(dá)60%時(shí)，進(jìn)行首次傳代。傳代時(shí)棄去舊培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶2～3滴，以覆蓋孔底為宜，室溫下消化，2～3min，鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化，棄去上清，加入2ml培養(yǎng)液，充分吹打制成細(xì)胞懸液，以1:1將細(xì)胞懸液移入15ml培養(yǎng)瓶，加入足量培養(yǎng)液培養(yǎng)。以后以1:2進(jìn)行傳代。免疫組化ABC法進(jìn)行波形絲蛋白和細(xì)胞角蛋白抗體染色，作細(xì)胞來源鑒定。

為檢測(cè)不同濃度rhBMP2對(duì)體外HPDLfs中cbfα1mRNA表達(dá)的影響，用高壓滅菌生理鹽水將rhBMP2凍干粉配制成25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml 3個(gè)濃度組。各濃度組分別觀察作用1、3、5、7天后，HPDLfs中cbfα1mRNA表達(dá)的變化。

分組設(shè)計(jì)為：對(duì)照組：HPDLfs＋2%DMEM；B1組：25ng/ml rhBMP2＋HPDLfs＋2%DMEM；B2組：50ng/ml rhBMP2＋HPDLfs＋2%DMEM；B3組：100ng/ml rhBMP2 ＋HPDLfs＋2%DMEM。

取4塊6孔培養(yǎng)板，4個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)各1塊。各培養(yǎng)板為3個(gè)濃度組及相應(yīng)對(duì)照組。每孔接種細(xì)胞懸液2ml，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下以含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液孵育24h后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分別加入rhBMP2，終濃度為25、50、100ng/ml，含2％FCS的DMEM培養(yǎng)，對(duì)照組為僅含2％FCS的DMEM。作用1、3、5、7天后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)cbfα1的表達(dá)

1.3.1細(xì)胞總RNA的提取：棄去每孔的培養(yǎng)液，每孔用1×PBS 2ml洗1遍，棄去PBS加入1mlTRIzol。

1.3.1.1溶解分離：①用移液器將細(xì)胞從孔底吹下，吹打壁上的細(xì)胞，0～15℃靜止5min，移入ep管中。②加入200μl氯仿震蕩15s，15～30℃度靜止2～3min，離心（12 000r/15min）。

1.3.1.2沉淀RNA：①吸出上層水相，移入新的ep管中；②加入500μl的異丙醇，15～30℃孵育10min，2～8℃，離心（12 000r/10min），棄上清。

1.3.1.3洗滌：①加入1ml 70%乙醇（DEPC水配制）渦旋2～8min，離心（7 500r/5min）；②室溫干燥5～10min。

1.3.1.4溶解：加入20μl DEPC水溶解RNA，55～60℃孵育10min。

1.3.1.5保存：-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄：紫外分光光度計(jì)定量取2μg總mRNA，加入1μg oligodT，70℃水浴10min后，立即置于冰上；加入 M-MLV 5×Buffer 5μl，10mM dNTP 4μl，200U/μlM-MLVRT 1μl，42℃水浴鍋中60min。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

1.3.3.1引物設(shè)計(jì)

①cbfa1的分子引物序列：該引物將產(chǎn)生333bp的cDNA片斷。

上游引物5' GCTTCAACTGGGCCCTTTTTCAG 3'

下游引物5' CCATCAGCGTCAACACCATCATTC 3'

②β-actin分子引物序列：該引物序列由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

上游引物5'TCCTGTGGCATCCATGAAACT3'

下游引物5'AACGCAGCTCAGTAACAGTC3'

1.3.3.2 PCR條件：在20μl的反應(yīng)體系中，模板cDNA第1條鏈?zhǔn)?μl，cbfa1引物（10pm/μl）1μl，dNTP (10mM) 2μl，Mg++(25mM) 1μl，10×PCR Buffer2ul，tag plus DNA聚合酶0.5μl加滅菌水至20μl。反應(yīng)條件為94℃變性 4min，94℃30s，54.5℃30s，72℃1.5min，35個(gè)循環(huán)。

1.3.3.3 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用Image Pro plus5.0測(cè)定電泳條帶熒光光密度值。

2結(jié)果

2.1 HPDLfs的形態(tài)觀察及鑒定結(jié)果：觀察到所培養(yǎng)細(xì)胞在形態(tài)上均呈長(zhǎng)梭形或星形，胞突細(xì)長(zhǎng)，胞體豐滿，胞漿均勻，中央有圓形或橢圓形的胞核，核仁清晰，一般有2～3個(gè)，呈成纖維細(xì)胞樣（如圖1）。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來源（如圖2～3）。最初的5代細(xì)胞3～5天即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底，生長(zhǎng)狀態(tài)活躍。6代以后的細(xì)胞，一般7～9天長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞增值穩(wěn)定。

2.2 各濃度組cbfα1mRNA的表達(dá)變化：不同濃度的rhBMP2作用于人牙周膜成纖維細(xì)胞，cbfα1mRNA的表達(dá)隨作用時(shí)間的變化而發(fā)生變化。內(nèi)對(duì)照基因β-actin為參照，各濃度組作用初期（1天）cbfα1的mRNA表達(dá)大幅度下降，當(dāng)作用至3天時(shí)，各組mRNA的表達(dá)明顯上升，B2、B3組mRNA的表達(dá)均在此時(shí)達(dá)到峰值，且組間無明顯差異。

隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各組mRNA的表達(dá)變化出現(xiàn)差異。B1組的表達(dá)繼續(xù)增高，于第5天達(dá)到峰值，且與其他兩組的峰值無明顯差異，繼續(xù)作用，第7天時(shí)，該組mRNA的表達(dá)恢復(fù)到作用前水平；B2組mRNA的表達(dá)則在第3天達(dá)到峰值后，迅速回落，并不隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而繼續(xù)上升，于第5天回落到作用前水平；B3組mRNA的表達(dá)則在達(dá)到峰值后，隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，但與B1、B2組相比，B3組mRNA的表達(dá)下降并不明顯，直至7天時(shí)，其mRNA的表達(dá)仍然高于對(duì)照組。RT-PCR凝膠成像結(jié)果如圖4～6。電泳條帶熒光光密度值見表1。

3討論

核心結(jié)合因子（cbfα1）是新近發(fā)現(xiàn)的成骨細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵因子[3]。已有研究表明[4]BMP2可以上調(diào)骨組織細(xì)胞中cbfα1mRNA，以調(diào)控其向骨系細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR測(cè)定不同濃度rhBMP2不同作用時(shí)間下的HPDLfs中cbfα1mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中cbfα1mRNA有微弱表達(dá)，與楊瑛[5]等研究一致。說明HPDLfs是具有類似骨祖細(xì)胞特性，在一定的條件下，可以向骨系細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步證明了HPDLfs在牙周改建中的作用。

3個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組，cbfα1mRNA的表達(dá)均在rhBMP2作用1天后顯著降低，其后表達(dá)出現(xiàn)明顯的增高，說明rhBMP2可以調(diào)節(jié)HPDLfs中cbfα1mRNA的表達(dá)。提示我們r(jià)hBMP2可能通過上調(diào)HPDLfs中cbfα1的轉(zhuǎn)錄水平，使得其向骨系細(xì)胞分化，進(jìn)而使細(xì)胞有成骨型表達(dá)。這與以往rhBMP2作用HPDLfs后引起細(xì)胞ALP活性增加、OC合成上升、礦化結(jié)節(jié)形成這些成骨型表現(xiàn)出現(xiàn)的研究[6]一致，并且更進(jìn)一步從基因轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)BMPs作用下HPDLfs向成骨細(xì)胞分化進(jìn)行了解釋。

比較3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，可以看到不同濃度組其對(duì)HPDLfs中cbfα1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控并不一致。一方面，就變化趨勢(shì)而言，B1（25ng/ml）和B2(50ng/ml)組均是在mRNA的表達(dá)增高達(dá)到峰值后迅速回落，而B3(100ng/ml)組則在峰值后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，直到作用7天時(shí)，mRNA的表達(dá)仍然處于較高水平。另一方面，就cbfα1mRNA表達(dá)增高達(dá)到峰值的作用時(shí)間而言，B2組和B3組一致，均在作用的3天達(dá)到峰值，B1組在作用5天后達(dá)到峰值?？梢姼邼舛冉M對(duì)cbfα1上調(diào)迅速且作用持久，而低濃度組上調(diào)相對(duì)緩慢且作用時(shí)間短暫。提示我們，HPDLfs對(duì)低濃度rhBMP2的作用反應(yīng)相對(duì)遲緩，且上調(diào)作用短暫；而對(duì)高濃度rhBMP2的作用反應(yīng)迅速而持久。這支持了rhBMP2對(duì)HPDLfs的作用具有劑量依賴性，HPDLfs成骨型表達(dá)與BMPs作用濃度正相關(guān)的研究。推測(cè)高濃度的BMPs可能通過對(duì)cbfα1mRNA表達(dá)進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的作用，從而使HPDLfs成骨型比低濃度組表現(xiàn)更為顯著。

3個(gè)濃度組對(duì)細(xì)胞cbfα1表達(dá)上調(diào)的峰值無明顯差異，說明cbfα1表達(dá)上調(diào)的幅度與rhBMP2的作用濃度無關(guān)，這提示BMPs對(duì)cbfα1的表達(dá)調(diào)控更類似啟動(dòng)部分，完全調(diào)控cbfα1的表達(dá)還需有其他因素。

本實(shí)驗(yàn)中，各個(gè)濃度組在第1天的表達(dá)均低于對(duì)照組，對(duì)此，尚無一個(gè)明確完善的解釋。推測(cè)，rhBMP2直接作用于HPDLfs后，瞬時(shí)高濃度rhBMP2打破了細(xì)胞原本的平衡，可能啟動(dòng)了HPDLfs胞內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制，存在特異的機(jī)制阻斷了中間信號(hào)分子，引起cbfα1的表達(dá)下降；隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，cbfα1的表達(dá)下降導(dǎo)致了中間信號(hào)分子轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)反饋增加，而使cbfα1的表達(dá)在第3天表達(dá)升高。這與BMP2作用下人牙乳頭細(xì)胞的研究相類似。

目前，在對(duì)于體外人牙周膜成纖維細(xì)胞cbfα1的研究主要集中在細(xì)胞加力后cbfα1的表達(dá)變化。與本實(shí)驗(yàn)不同的是，間歇性牽張力作用下HPDLfs中cbfα1的表達(dá)增高要迅速得多[7]，并且呈一過性反應(yīng)[5]，并且猜想，cbfα1在外力作用下反應(yīng)迅速而短暫，類似立即早期基因，可能在機(jī)械力誘導(dǎo)骨形成中起到“啟動(dòng)子”或“扳機(jī)點(diǎn)”的作用。對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，機(jī)械力直接作用和生物活性物質(zhì)直接胞外作用，雖然都可以引起HPDLfs中cbfα1mRNA表達(dá)的增高，但顯然HPDLfs對(duì)機(jī)械信號(hào)和生物活性物質(zhì)這兩種作用的反應(yīng)性不盡相同。正畸力作用下，體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中的HPDLfs中cbfα1究竟是通過怎樣的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活，還需要進(jìn)一步深入研究。

4結(jié)論

基于實(shí)驗(yàn)各組中cbfα1的表達(dá)變化，提示我們BMPs可以上調(diào)HPDLfs中cbfα1的轉(zhuǎn)錄水平，并且對(duì)cbfα1的表達(dá)調(diào)控主要為啟動(dòng)作用，cbfα1的表達(dá)增高幅度似乎與rhBMP2濃度并不相關(guān)。高濃度組對(duì)cbfα1的上調(diào)作用迅速而持久，低濃度組的作用則相對(duì)遲緩而短暫。

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[收稿日期]2011-03-10[修回日期]2011-05-03

編輯/何志斌

注：“本文中所涉及到的圖表、公式、注解等請(qǐng)以PDF格式閱讀”