UVB照射對(duì)PIG1細(xì)胞增殖活性的影響

[摘要]目的：探討UVB照射對(duì)正常人黑素細(xì)胞PIG1細(xì)胞形態(tài)及增殖活性的影響。方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PIG1細(xì)胞，分別以50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2劑量的UVB照射后繼續(xù)培養(yǎng)0h、24h和48h，在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，用MTT法檢測(cè)UVB照射對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果：在50～200 mJ/cm2的UVB輻射下，隨輻射劑量的增大，PIG1細(xì)胞的增殖活性逐漸增加，倒置相差顯微鏡從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了一定劑量的UVB照射可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)論：一定劑量的UVB照射有刺激PIG1細(xì)胞增殖及樹(shù)突生長(zhǎng)的作用。

[關(guān)鍵詞]PIG1細(xì)胞；UVB照射；增殖；樹(shù)突

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2011）06-0944-03

Effect of UVB irradiation on the proliferation of PIG1 cells

ZHU Dong-ning，JIAN Qiang，XUE Ke，LIU Bo-qiang，WANG Ling，LI Cheng-xin

(Department of Dermatology，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi'an710032， Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of UVB irradiation on the proliferation of PIG1 cells.MethodsMorphology change of PIG1 cells was observed by light microscopy.MTT assay was used to record cellular activity.ResultsAfter UVB irradiation，the number of PIG1 cells was increased and the length of dendrites was extended. The proliferation activity of PIG1 cells was dependent on the irradiated dosages (50～200mJ/cm2).ConclusionsUVB irradiation can promote the proliferation activity of PIG1 cells and extend the dendrites of PIG1.

Key words:PIG1 cells; UVB irradiation; proliferation;dendrites

過(guò)量的紫外線照射可以導(dǎo)致皮膚灼傷、曬黑及免疫抑制，長(zhǎng)期作用還可以引起皮膚光老化，并誘發(fā)皮膚癌[1-2]。紫外線輻射按波長(zhǎng)不同分為UVA(315～400nm)、UVB(280～315nm)和UVC(100～280nm)。太陽(yáng)輻射通過(guò)大氣層時(shí)所有的UVC 和大約90%的UVB 能被臭氧、水汽、氧和二氧化碳吸收[3]， 但是由于地球上方臭氧空洞的形成及增大， 大氣層對(duì)UVB 的吸收減弱， 導(dǎo)致到達(dá)地球表面的UVB 的量迅速增加， 因此UVB對(duì)生物體損傷的機(jī)制及其防護(hù)的研究具有理論和實(shí)際意義[4-5]。目前，關(guān)于UVB照射對(duì)PIG1細(xì)胞增殖影響的研究多集中在采用單一或少數(shù)幾組照射劑量，在照射后24h觀察細(xì)胞增殖活性的變化[5-7]。本實(shí)驗(yàn)采用一組均勻遞增的照射劑量，分別在照射后24h及48h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，以測(cè)定不同劑量UVB照射對(duì)PIG1細(xì)胞增殖活性的影響，以進(jìn)一步探討UVB照射與PIG1細(xì)胞增殖活性間時(shí)效與量效的關(guān)系。

1材料和方法

1.1主要試劑：254培養(yǎng)基購(gòu)自Cascade Biologics公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自GibcoBRL公司，HMGS添加劑購(gòu)自Cascade Biologics公司，胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與接種：永生化的人表皮黑素細(xì)胞系PIG1來(lái)自美國(guó)艾利諾斯州Loyola醫(yī)學(xué)中心。用含有5%胎牛血清的254培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PIG1細(xì)胞消化后以2×104/ml的密度接種于96孔板，用于細(xì)胞活性檢測(cè)。接種后的PIG1細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合度時(shí)接受UVB照射。

1.2.2 UVB照射方法及能量密度的選擇：實(shí)驗(yàn)使用上海希格瑪公司生產(chǎn)的紫外線光療儀，輻照度以UVB輻照度監(jiān)示器標(biāo)定，UVB劑量=UVB輻照度×?xí)r間(s)。由于254培養(yǎng)液可吸收一定的光量子而引起誤差，因此每次照射前吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次后，96孔板每孔中加入100μl PBS。分別選用0、50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2照射。照射后吸去PBS重新加入254培養(yǎng)基，培養(yǎng)至24h及48h檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性：取接受不同能量照射后的PIG1細(xì)胞進(jìn)行MTT比色試驗(yàn)，每孔加入20μl 5mg/m1的MTT溶液終止培養(yǎng)，在CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去培養(yǎng)液，再每孔加入150μl DMSO，充分振蕩培養(yǎng)板10min，酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值（A 值），用DMSO空白孔校零，計(jì)算細(xì)胞存活率（%）＝UVB照射組A490/空白對(duì)照組A490×100%。

1.2.4倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：以劑量0、50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2UVB輻射細(xì)胞，在照射后0h、24h和48h以倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，照射組與對(duì)照組及照射組間比較采用SPSS12.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 UVB照射對(duì)PIG1細(xì)胞活性的影響：用不同能量（0、50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2）的UVB照射PIG1細(xì)胞，觀察24h時(shí)的細(xì)胞增殖活性（圖1）。照射能量在50、100mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞增殖活性高于照射前水平（P＜0.05），50mJ/cm2時(shí)細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)；而照射能量高于200mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞增殖活性低于照射前水平，并隨著能量升高呈逐漸下降趨勢(shì)。

觀察用上述能量的UVB照射PIG1細(xì)胞后48h時(shí)的細(xì)胞增殖活性（圖2）。照射能量在100mJ/cm2時(shí)細(xì)胞活性有一定程度的恢復(fù)，而到400mJ/cm2后呈下降趨勢(shì)。100mJ/cm2時(shí)的細(xì)胞增殖活性較24h升高，200 mJ/cm2時(shí)細(xì)胞活性達(dá)最大值，而24h則從200mJ/cm2時(shí)開(kāi)始下降。

2.2 UVB照射對(duì)PIG1細(xì)胞形態(tài)的影響：選擇能穩(wěn)定增加PIG1活性的能量100mJ/cm2照射后48h，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化（圖3）。A、B圖分別是未照射組及照射組照射后即刻的細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)相似；D圖為100mJ/cm2 UVB照射PIG1后48h，相對(duì)于培養(yǎng)至48h的未照射組（C圖）細(xì)胞數(shù)量明顯增多，樹(shù)突顯著延長(zhǎng)。

3討論

3.1 紫外線是電磁波譜中波長(zhǎng)從0.01～0.40μm輻射的總稱(chēng)。它是一種外源性的促細(xì)胞分裂劑，黑素細(xì)胞膜上有光受體，紫外線照射能引起黑素細(xì)胞的增殖及黑素生成，導(dǎo)致黑素沉著。皮膚的色素沉著主要由UVB引起，UVB的生物學(xué)效應(yīng)強(qiáng)度是UVA 的800～1000倍，是引起皮膚光損傷的最重要波段[8]。本研究采用UVB光源，以PIG1細(xì)胞為輻射細(xì)胞，進(jìn)行光損傷方面的研究。

3.2 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同能量UVB照射對(duì)PIG1細(xì)胞活性的影響時(shí)，選用0、50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2進(jìn)行照射，選擇這組均勻遞增的能量在照射后24h及48h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞活性，能夠較好的反映出UVB照射與PIG1細(xì)胞增殖活性間時(shí)效與量效的關(guān)系。在24h時(shí)，細(xì)胞活性在50mJ/cm2時(shí)開(kāi)始上升，200mJ/cm2時(shí)低于照射前水平，并隨著能量升高呈下降趨勢(shì)。以上提示PIG1細(xì)胞可以耐受一定能量范圍內(nèi)的照射，當(dāng)UVB照射能量增強(qiáng)到某個(gè)值時(shí)PIG1細(xì)胞才會(huì)被損傷。而在48h時(shí)，細(xì)胞活性在100mJ/cm2時(shí)有一定程度的恢復(fù)，而到400mJ/cm2后呈下降趨勢(shì)。這可能與細(xì)胞可以清除自身光損傷產(chǎn)物這一性質(zhì)有關(guān)。通過(guò)UVB照射對(duì)PIG1細(xì)胞活性影響的時(shí)效性分析我們發(fā)現(xiàn)：UVB照射能量100mJ/cm2時(shí)能夠較穩(wěn)定增加細(xì)胞活性。提示一定劑量的UVB照射有刺激PIG1細(xì)胞增殖的作用。而選擇超過(guò)100mJ/cm2的能量照射時(shí)，PIG1細(xì)胞的活性受到抑制。而這種抑制作用并不是持續(xù)性的，細(xì)胞活性會(huì)在一段時(shí)間后恢復(fù)，因此在這種情況下UVB對(duì)PIG1細(xì)胞表現(xiàn)出的損傷作用是可逆性的。

3.3 由于UVB照射能量在100mJ/cm2時(shí)能夠較穩(wěn)定增加細(xì)胞活性，因此選擇100mJ/cm2UVB照射PIG1后48h 觀察了細(xì)胞形態(tài)的變化。光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果示PIG1細(xì)胞相對(duì)于未照射組數(shù)目明顯增加，樹(shù)突明顯延長(zhǎng)增多。提示UVB照射有刺激樹(shù)突生長(zhǎng)的作用。這在形態(tài)上進(jìn)一步證實(shí)了一定劑量的UVB可促進(jìn)PIG1細(xì)胞的增殖。

3.4 人體皮膚的色素沉著過(guò)程非常重要，它不僅決定皮膚、眼睛和頭發(fā)的顏色，還可以保護(hù)皮膚免受紫外線的過(guò)度照射。該過(guò)程不僅包括黑素合成，黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的傳遞也起到了非常重要的作用，為確保黑素小體的運(yùn)動(dòng)與傳遞，有效的樹(shù)突形成是必須的前提條件[9-10]。一定劑量的UVB照射可以促進(jìn)PIG1細(xì)胞的增殖，并可以促進(jìn)樹(shù)突的生長(zhǎng)，這就為黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞的傳遞提供了形態(tài)學(xué)上的條件。本研究從體外初步觀察了UVB照射對(duì)PIG1細(xì)胞增殖的影響，為研究紫外線照射與皮膚色素沉著的關(guān)系提供了依據(jù)。UVB照射對(duì)色素沉著過(guò)程中黑素合成及轉(zhuǎn)運(yùn)的影響有待于進(jìn)一步地研究。

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[收稿日期]2011-03-29[修回日期]2011-05-18

編輯/張惠娟

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