反義結(jié)締組織生長(zhǎng)因子對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的作用

[摘要]目的： 研究結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)反義寡核苷酸(ASODN)對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞CTGFmRNA的表達(dá)和細(xì)胞增殖及膠原合成的影響，探討瘢痕疙瘩的基因治療。方法：體外分離、培養(yǎng)人正常皮膚成纖維細(xì)胞(NSF)和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KF)，以脂質(zhì)體介導(dǎo)方法將CTGFASODN轉(zhuǎn)染KF中，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)細(xì)胞中CTGFmRNA的表達(dá)；采用MTT方法測(cè)細(xì)胞增殖；3H-脯氨酸摻入法檢測(cè)細(xì)胞的膠原合成量。 結(jié)果：CTGFmRNA在NSF中幾乎無(wú)表達(dá)，在KF中表達(dá)增高，CTGFASODN可以抑制其增殖和膠原合成(P<0.05)。結(jié)論：CTGFASODN能夠抑制成纖維細(xì)胞CTGFmRNA表達(dá)和細(xì)胞增殖及膠原合成，表明阻斷CTGF可能是延緩瘢痕纖維化的有效手段。

[關(guān)鍵詞]結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；反義寡核苷酸；瘢痕疙瘩

[中圖分類號(hào)]R619+.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2011）06-0936-03

Effects of connective tissue growth factor antisense oligonucleotides on the cultured human keloid fibroblasts

REN Li-hong1， DUAN Guo-xin2， YANG Da-ping1， LIU Ying1， XIAO Zhi-bo1， TENG Wen1， LIU Guo-feng1

（1.Plastic Cosmetic Center，The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China; 2.Department of Plastic Surgery，Shengmeijia Plastic Surgery Clinic，Shenzhen 518000，Guangdong，China）

Abstract:ObjectiveTo explore the effects of connective tissue growth factor(CTGF) antisense oligonucleotides on the expression of CTGF mRNA， cell proliferation and collagen synthesis in the cultured human keloid fibroblasts. MethodsNormal skin fibroblasts(NSF) and keloid fibroblasts(KF) were cultured in vitro， CTGF antisense oligonucleotides were transfected into the KFs by liposome. The expression of CTGFmRNA was assessed by reverse transcription polymerase chain reaction method(RT-PCR).Cell proliferation was detected by MTT method and the collagen synthesis of KF was assessed by 3H-proline incorporation method.ResultsCTGFmRNA was strongly expressed in KF(P<0.05)， whereas it was not expressed in NSF. CTGF antisense oligonucleotides could inhibited CTGFmRNA expression， cell proliferation and collagen synthesis.ConclusionsCTGF antisense oligonucleotides could inhibited the expression of CTGFmRNA， cell proliferation and collagen synthesis， implying that CTGF may be a potential therapeutic target to scar fibrosis.

Key words: connective tissue growth factor; antisense oligonucleotides; keloid

瘢痕疙瘩(Keloid)是以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞成分過(guò)度增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的皮膚纖維化疾病[1]，目前其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的下游效應(yīng)因子，是一個(gè)重要的促纖維化細(xì)胞因子[2]，其過(guò)度表達(dá)與某些纖維化性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如硬皮病、腎纖維化、肝纖維化、肺纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化等[3-4]。

反義寡核苷酸能以序列特異方式抑制基因表達(dá)，在治療癌癥、微生物感染、自身免疫病等方面取得了可喜成績(jī)。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KF)觀察CTGF反義寡核苷酸（ASODN）對(duì)CTGFmRNA的表達(dá)，成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響，探討CTGF在瘢痕纖維化中可能的作用。

1材料和方法

1.1標(biāo)本取材：取自哈醫(yī)大二院整形美容科手術(shù)標(biāo)本，包括正常皮膚4例，瘢痕疙瘩10例。男8例，女6例；年齡16～37歲；瘢痕增生的時(shí)間在3～6個(gè)月。

1.2試劑和材料：RPMI1640培養(yǎng)液、新生胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；Dotap脂質(zhì)體（美國(guó)Biontex公司）；TRIzol Reagent、 RT-PCR試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；3H-脯氨酸（中國(guó)原子能核物理所）；液閃測(cè)定儀（美國(guó)Beckman公司）。

1.3CTGF ASODN的合成：CTGF反義寡核苷酸堿基序列為：5，-TACTGGCGGCGGTCAT-3，[5]，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行全硫代化修飾及5，-異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記，由上海生工生物工程公司合成。

1.4組織塊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：將手術(shù)中切下的正常皮膚、瘢痕疙瘩組織在無(wú)菌條件下去除表皮后用PBS漂洗3次，用眼科剪剪成約1mm3的碎塊，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃，5%CO2條件下原代培養(yǎng)。每2天換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞接近80%融合時(shí)，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化傳代。在傳代至3～5代時(shí)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)分三組：①正常皮膚成纖維細(xì)胞(NSF)；②瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KF)；③KF+CTGF ASODN。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用無(wú)血清、無(wú)抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液分別稀釋CTGF ASODN和Dotap脂質(zhì)體，室溫下靜置30min后等量混勻，即形成反義ODN-脂質(zhì)體復(fù)合物。向第3組滴加入ASODN-脂質(zhì)體復(fù)合物(兩者終濃度為20μg/ml[5])繼續(xù)培養(yǎng)，胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)改為5%，其余條件同前。

1.6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：于轉(zhuǎn)染后48h按照TRIzol說(shuō)明書在培養(yǎng)瓶中提取總RNA，1%甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA樣本的完整性良好，并用RNA/DNA計(jì)算器檢測(cè)RNA的濃度。取RNA2.0μg作逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為70℃10min，37℃60min，99℃5min.取1μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，三磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)為外參照，將CTGF與G3PDH同等條件擴(kuò)增。預(yù)期CTGF的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度微766bp，上游引物為5，-GCCCAGACCCAACTATGA-3，下游引物為5，-ACCCTCCCAC TGCTCCTA-3，；G3PDH的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為450bp，上游引物為5，-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物為5，-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3，。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變3min、94℃變性40s、56℃退火 40s、72℃延伸40s，共循環(huán)30次，72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物5μl在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相，用計(jì)算機(jī)圖象處理系統(tǒng)分析，計(jì)算目的基因、G3PDH基因條帶相對(duì)吸光度。

1.7MTT法測(cè)成纖維細(xì)胞增殖每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，每組做三孔，取平均值。分別于轉(zhuǎn)染6、12、24、48、72h取出一塊培養(yǎng)板，用MTT法測(cè)定各孔光吸收值，以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.83H-脯氨酸摻入法測(cè)成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成：瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞1×104個(gè)/孔分種于24孔培養(yǎng)板上，于轉(zhuǎn)染48h后吸棄上清液，加入3H-脯氨酸繼續(xù)培養(yǎng)10h，多孔收集器收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，液閃測(cè)定儀閃爍記數(shù)測(cè)定3H-脯氨酸摻入量。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果：CTGFmRNA在NSF組中表達(dá)極弱，在KF中表達(dá)增強(qiáng)，ASODN組CTGFmRNA表達(dá)減弱(圖1)。CTGFmRNA的表達(dá)量經(jīng)方差分析，CTGF ASODN組表達(dá)量（0.28±0.62）顯著低于KF組（0.74±0.16），差異有顯著性意義（P<0.05）。

2.2 CTGFASODN對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響：NSF組、KF組曲線逐漸升高，其中KF組升高幅度明顯大于NSF組；而KF+CTGFASODN組在轉(zhuǎn)染后第6h生長(zhǎng)曲線明顯呈下降趨勢(shì)，至72h降至最低（見(jiàn)圖2）。

2.3 CTGFASODN對(duì)KF膠原合成的作用：利用3H-脯氨酸摻入，在無(wú)血清培養(yǎng)的條件下，觀察CTGFASODN對(duì)KF膠原合成的影響。其中，KF組中膠原合成量（5891±182）明顯較NSF組（1367±218）增多 (P<0.05)；而CTGFASODN對(duì)KF膠原合成（3487±629）有明顯抑制作用，差異有顯著性意義(P<0.05)。

3討論

在許多纖維化疾病中CTGF與TGF-β1的表達(dá)同步增高[6]。Grotendorst等[7]發(fā)現(xiàn)，在CTGF啟動(dòng)子-162～-128核苷酸序列中有一個(gè)TGF-β1反應(yīng)元件，其點(diǎn)突變可以導(dǎo)致TGF-β1活性完全喪失，故認(rèn)為CTGF是TGF-β1致纖維化作用的直接下游效應(yīng)介質(zhì)。

反義寡核苷酸技術(shù)是根據(jù)核酸間結(jié)合需遵循堿基互補(bǔ)原則這一原理，使用與目的基因特定互補(bǔ)的短核苷酸片段阻斷目的基因的表達(dá)。脂質(zhì)體具有安全、高效、使用方便和無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，可以使細(xì)胞攝取寡核苷酸的能力增加10～20倍。

研究結(jié)果顯示，從mRNA水平看，CTGF在正常皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)極其微弱，在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)增高，因此我們推測(cè)在瘢痕疙瘩纖維進(jìn)程中，可能伴隨著CTGF DNA向mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程的啟動(dòng)以及高水平轉(zhuǎn)錄的持續(xù)存在，進(jìn)而翻譯成CTGF蛋白質(zhì)，后者發(fā)揮生物學(xué)活性刺激組織中成纖維細(xì)胞增殖和外基質(zhì)合成增加，增殖的成纖維細(xì)胞又產(chǎn)生更多的CTGF，這樣惡性循環(huán)，最終形成大量的纖維化組織，導(dǎo)致瘢痕形成。

MTT是一種淡黃色唑氮鹽，是線粒體脫氫酶的作用底物，經(jīng)活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶的消化作用，被還原成不溶于水的藍(lán)紫色form azan的結(jié)晶。結(jié)晶溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，來(lái)反映細(xì)胞的增殖能力和存活情況。體外培養(yǎng)的KF的MTT生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示CTGFASODN能明顯抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活性，表現(xiàn)為生長(zhǎng)曲線逐 漸下降。

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中最活躍的成分之一，是創(chuàng)面愈合和瘢痕形成的關(guān)鍵因素，膠原蛋白的異常合成與沉積是病理性瘢痕的基礎(chǔ)?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)3H標(biāo)記的脯氨酸摻入膠原的量來(lái)分析膠原合成速度，3H-脯氨酸摻入結(jié)果顯示，CTGFASODN能夠抑制體外培養(yǎng)的KF合成膠原。

由于RT-PCR證實(shí)ASODN轉(zhuǎn)染后KF中CTGFmRNA表達(dá)水平較KF降低，證明CTGFASODN抑制KF增殖并抑制其膠原合成，均是由于其有效的抑制了KF內(nèi)CTGF的基因轉(zhuǎn)錄，說(shuō)明CTGF ASODN成功地發(fā)揮了其反義抑制作用。

許多年以來(lái)， TGF-β1被認(rèn)為是促進(jìn)瘢痕纖維化的最重要的生長(zhǎng)因子之一[8]，但他同時(shí)也是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗炎等重要生物學(xué)活性，研究表明新生小鼠敲除TGF-β1基因，在出生后很快死于全身炎癥，鑒于TGF-β1作用的靶細(xì)胞種類繁多、生物學(xué)效應(yīng)復(fù)雜，因此完全阻斷其表達(dá)或活性的后果是難以預(yù)料的[9-11]。相比之下，CTGF作為TGF-β1的下游效應(yīng)因子，特異性介導(dǎo)TGF-β1的促纖維化效應(yīng)，因此，阻斷CTGF的生物學(xué)效應(yīng)可能是一條相對(duì)安全的延緩瘢痕纖維化的新途徑。

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[收稿日期]2011-03-26 [修回日期]2011-05-16

編輯/張惠娟

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