CXCR4靶向shRNA質(zhì)粒載體的制備和體外鑒定

[摘要]目的:設(shè)計(jì)并構(gòu)建CXCR4靶向shRNA質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞株，驗(yàn)證shRNA對黑色素瘤CXCR4基因的沉默效應(yīng)。方法:設(shè)計(jì)合成CXCR4特異性shRNA，將其插入pSilencer質(zhì)粒載體，并將重組后的pSilencer質(zhì)粒載體經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染黑色素瘤MV3細(xì)胞株，抗性篩選穩(wěn)定抑制CXCR4表達(dá)的永久性克隆。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測shRNA對黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)CXCR4 mRNA表達(dá)，應(yīng)用Western blot法檢測CXCR4蛋白變化。結(jié)果:成功構(gòu)建和篩選出CXCR4特異性的shRNA質(zhì)粒載體及穩(wěn)定抑制CXCR4表達(dá)的永久性細(xì)胞克隆。陽性克隆測序結(jié)果表明合成的寡核苷酸鏈序列插入正確。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA的高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞MV3的CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)較空白對照組明顯下調(diào)。結(jié)論:脂質(zhì)體介導(dǎo)shRNA體內(nèi)表達(dá)法制備的CXCR4-shRNA在黑色素瘤細(xì)胞中可獲得高效轉(zhuǎn)染，并能產(chǎn)生特異性的基因沉默效應(yīng)，以CXCR4為靶向的shRNA能夠有效下調(diào)CXCR4基因的表達(dá)，有望為轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的靶向基因治療提供一條新途徑。

[關(guān)鍵詞]黑色素瘤;趨化因子受體CXCR4;shRNA;質(zhì)粒

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)08-1167-04

Construction and in vitro identification of CXCR4 target plasmid vector of short hairpin RNA

WU Bao-jin1，2，JIANG Hua2，LI Wen-peng3，WU Jian-ming2，ZHANG Ying-fan2，DING Wei1

(1.Department of Plastic Surgery，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200003，China; 2.Department of Plastic Surgery，Changzheng Hospital，the Second Military Medical University; 3. Department of Plastic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine)

Abstract:ObjectiveTo construct a CXCR4 specific shRNA recombinant plasmid vector and identify its inhibiting effect on the gene expression of CXCR4 in melanoma cell lines. MethodsA CXCR4 specific recombinant plasmid vector was prepared and transfected into the cultured MV3 cell line with lipofectamine 2000. RT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of CXCR4， respectively.ResultsCXCR4 specific shRNA was constructed and transfected into the MV3 cell line. Agarose gel electrophoresis confirmed the vector had been inserted in the production of PCR， and sequencing result showed that composite CXCR4-shRNA inserting correctly in the positive clone. Both the CXCR4 protein and mRNA expression in the CXCR4-shRNA group were significantly lower than that of the control group.ConclusionCXCR4-shRNA can be highly effectively transfected into melanoma cell， and induced post-transcriptional gene silencing of CXCR4， which may become a potential target in the prevention and treatment of invasion and metastasis of melanoma.

Key words:melanoma;chemokin receptor CXCR4;short hairpin RNA; plasmid

RNA干擾 (RNA interference， RNAi)是近年發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)mRNA的生物學(xué)現(xiàn)象，它能使基因表達(dá)的mRNA被相應(yīng)的雙鏈RNA分子敲除，從而引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing， PTGS)，其效果遠(yuǎn)強(qiáng)于正義和反義RNA[1]。目前研究表明，參與這種RNAi作用的主要分子是雙鏈RNA，在細(xì)胞內(nèi)以21-23個(gè)核苷酸的形式發(fā)揮作用，而且己有人工合成雙鏈siRNA，具有明顯敲除相應(yīng)基因mRNA的效果[2]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4在某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并可能在侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[3-6]。在黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移中對其正相關(guān)基因的抑制，是值得探索的思路之一。本研究通過構(gòu)建CXCR4靶向shRNA的質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞株，驗(yàn)證shRNA對CXCR4的沉默作用，為后期進(jìn)一步研究CXCR4基因沉默阻斷SDF-1/CXCR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料:MV3細(xì)胞株系人轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞株，B16F10系小鼠高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫。pSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒購自Ambion公司，內(nèi)含四環(huán)素Ampr抗性基因和人U6啟動(dòng)子以及新霉素抗性篩選標(biāo)記。PCR引物由上海申工合成。

1.2人CXCR4 shRNA脫氧寡核苷酸片段shRNA設(shè)計(jì):從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲取CXCR4 cDNA的完整序列。根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原理和哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞siRNA的Tuschl AA-19nt的設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Ambion公司提供的在線工具，設(shè)計(jì)一對shRNA序列的模版DNA和無關(guān)對照shRNA模版DNA。根據(jù)在線從CXCR4基因的mRNA序列中篩選1條shRNA靶序列，并合成相應(yīng)的正義和反義DNA 鏈模板。以上模板DNA鏈寡核苷酸包括BamHI酶切位點(diǎn)、19nt正義序列、RNA PolⅢ終止子和HindⅢ酶切位點(diǎn)。同時(shí)設(shè)計(jì)好陰性對照模板，設(shè)計(jì)的siRNA序列在GenBank表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫中用BLAST檢索后排除與人體其他任何mRNA有同源性。對照組序列不針對人體任何mRNA 序列，確定序列的唯一性。

1.3合成DNA片段和雙鏈模板DNA:按照上面CXCR4-shRNA正反義鏈序列合成DNA片段。將合成片段分別溶于雙蒸水中，配制成100pmol/μl的溶液。每條正義鏈分別與其反義鏈退火后，形成一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和HindⅢ酶及黏性末端。12%非變性PAGE凝膠檢測雙鏈形成效率，凝膠成像儀檢測電泳條帶。

1.4CXCR4-shRNAR表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建及鑒定:BamHI和HindⅢ酶切處理pSilencerTM 3.1-H1 neo表達(dá)質(zhì)粒載體(AM5770; Vector Size: 4285 bp; 20rxns)，形成線性片段，除去酶切下來的小片段而純化，使其不發(fā)生自身連接。用T4 DNA連接酶將退火后的雙鏈核苷酸片段插入線性化載體。使用BamHI和HindⅢ酶切處理pSilencerTM 3.1-H1 neo表達(dá)質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切消化。

1.5連接(克隆制備)和轉(zhuǎn)化:將退火形成雙鏈DNA與經(jīng)BamHI和HindⅢ酶切的pSilencerTM 3.1-H1 neo載體連接。于4℃ 12h連接反應(yīng)，制備克隆連接液，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加2μl 連接液，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。將管放到預(yù)加溫到42℃的循環(huán)水浴中放好的試管架上90s?？焖賹⒐苻D(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻l～2min。每管加800μl SOC培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇。將150μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和Amp抗性的 SOB瓊脂培養(yǎng)基上。將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，16h。陽性克隆PCR鑒定后菌液送測序。選擇測序鑒定正確的克隆，將保存的正確的單克隆菌液接種于2～5ml抗性LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)說明進(jìn)行陽性克隆質(zhì)粒抽提篩選。設(shè)轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染無關(guān)對照shRNA載體的細(xì)胞為無關(guān)對照組。

1.6RT-PCR檢測CXCR4 mRNA表達(dá):以人MV3細(xì)胞作為空對照，分別取實(shí)驗(yàn)組、無關(guān)對照組和空白對照組細(xì)胞，按Trizol試劑說明書操作提取細(xì)胞總RNA，用于擴(kuò)增人CXCR4 cDNA。PCR引物由上海申工合成。PCR擴(kuò)增后行1%瓊脂糖凝膠電泳，用圖像掃描儀拍照并進(jìn)行條帶灰度分析，以CXCR4與GAPDH的比值代表其相對含量。

1.7Western blot 檢測CXCR4蛋白的表達(dá):取實(shí)驗(yàn)組、無關(guān)對照組和空白對照組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，用BC試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。取PBS、各樣品10μl，加DW990μl;取DW勻漿緩沖液、樣品稀釋液、系列牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度0.5ml;向各管加入2.5ml D試劑混勻，靜置10min;迅速加入酚試劑0.25ml，混勻37℃水浴30min;721分光光度計(jì)650nm，比色，SO標(biāo)準(zhǔn)管調(diào)零;最后稀釋為4μg/μl，加載樣緩沖液后終濃度2μg/μl，上樣量30～80μg/泳道。灌制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣50μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，依次與CXCR4抗體(1:200)及HRP標(biāo)記的二抗(1:500)反應(yīng)1h，化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，紫外分光光度計(jì)掃描各條帶灰度植值以反映蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。內(nèi)參照為β-actin。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采集數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1shRNA載體質(zhì)粒酶切鑒定與純化:pSilencerTM 3.1-H1 neo載體酶切反應(yīng)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)，線性化后的質(zhì)粒與未經(jīng)酶切的質(zhì)粒的電泳遷移率不同(圖1A)，線性化后的質(zhì)粒泳遷移速率稍快于未經(jīng)酶切的質(zhì)粒。DNA雙鏈退火后經(jīng)12%PAGE凝膠電泳，可見在3、4泳道形成條帶的與雙鏈對照泳道形成的條帶在同一水平線上(圖1B)。

2.2PCR鑒定重組質(zhì)粒與陽性克隆質(zhì)粒抽提:實(shí)驗(yàn)組和無關(guān)對照組經(jīng)PCR檢測均可見約320bp的條帶，與預(yù)測目的條帶大小相符，與之相對應(yīng)的兩個(gè)空質(zhì)粒均沒有條帶，說明插入序列均整合到載體上。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示圖中可見雙鏈、超螺旋質(zhì)粒占絕大部分，說明質(zhì)粒抽提質(zhì)量高(圖2)。

2.3CXCR4-shRNA陽性克隆PCR鑒定:退火形成雙鏈DNA與經(jīng)BamHI和HindⅢ酶切的pSilencerTM 3.1-H1 neo載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取重組陽性克隆，行PCR鑒定陽性克隆，重組細(xì)菌克隆的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)泳道4～9的PCR產(chǎn)物條帶電泳遷移率慢于泳道3即空載組的PCR產(chǎn)物條帶，說明泳道4～9均為插入片段陽性的克隆(圖3)。挑選陽性克隆CXCR4-shRNA菌液送測序。

2.4重組質(zhì)粒序列測定:測序結(jié)果與目的序列完全相同，表明構(gòu)建重組質(zhì)粒成功。插入部分序列圖譜測序結(jié)果表明合成的CXCR4-shRNA寡核苷酸鏈序列插入正確(圖4)。

2.5shRNA對人轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞MV3 內(nèi)CXCR4 mRNA表達(dá)的影響

半定量RT-PCR DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析顯示，各組樣本均可見這亮度均一的GAPDH對照條帶，實(shí)驗(yàn)組CXCR4目的DNA條帶亮度較空白對照組淺，無關(guān)對照組目的DNA條帶無明顯變化(圖5)。

CXCR4-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MV3細(xì)胞后，CXCR4 mRNA的表達(dá)水平明顯低于空白對照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組、無關(guān)對照組和空白對照組中CXCR4 mRNA的表達(dá)水平分別為20.6%±5.1%、70.6%±2.6%和72.2%±3.9%。無關(guān)對照組與空白對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 shRNA對人轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞MV3 內(nèi)CXCR4蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組CXCR4-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MV3細(xì)胞后，CXCR4蛋白的表達(dá)明顯被抑制(圖6)。實(shí)驗(yàn)組、空白對照組和無關(guān)對照組中CXCR4蛋白的表達(dá)率分別為12.8%±2.3%、41.1%±1.9%和38.5%±2.7%。空白對照組和無關(guān)對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組較空白對照組其表達(dá)率顯著下降(P<0.01)。

3討論

CXCR4作為HIV入侵機(jī)體的協(xié)同受體，1996年由Feng等首先克隆出來[7]。以往研究表明，CXCR4與其特異配體SDF-1相互作用可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)，從而介導(dǎo)細(xì)胞參與各種生理和病理過程如炎癥細(xì)胞的移行、造血干細(xì)胞的歸巢、血管生成、造血系統(tǒng)與淋巴系統(tǒng)的發(fā)育和成熟等[8-10]。

目前已有研究者利用RNA干擾技術(shù)針對CXCR4作腫瘤生物學(xué)特性的相關(guān)研究，并在抑制乳腺癌、結(jié)腸癌等的轉(zhuǎn)移中顯現(xiàn)出明顯的效果[11]，但CXCR4 shRNA能否抑制黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的CXCR4 shRNA載體將為其黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用奠定基礎(chǔ)。

近年來siRNAs代替反義核苷酸技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已經(jīng)迅速而廣泛地應(yīng)用到基因功能、基因表達(dá)調(diào)控、藥物靶篩選、調(diào)控細(xì)胞行為等熱門領(lǐng)域，并為基因治療開辟了新的途徑[12]。RNAi最重要的臨床應(yīng)用就是在基因治療領(lǐng)域，通過“敲除”一個(gè)或多個(gè)特異蛋白的表達(dá)來減慢或終止疾病的致病過程，達(dá)到治療的目的。雖然理論上對于不同的疾病RNAi均具有一定的效果，但截止到目前RNAi技術(shù)主要應(yīng)用于癌癥和傳染病的治療方面[13]。

自然界中存在3種干涉mRNA的機(jī)制:反義RNA、核酶和RNAi[14]。siRNA 的優(yōu)點(diǎn)在于:在抑制基因表達(dá)的效果上，雙鏈RNA對靶基因的抑制效果至少比單鏈反義RNA的抑制效果強(qiáng)2個(gè)數(shù)量級。事實(shí)上，反義RNA的基因抑制效果可能取決于它形成dsRNA的能力。相對于反義RNA和核酶技術(shù)，RNAi沉默效果基本不受RNA二級結(jié)構(gòu)的影響。在體外得到siRNA后再導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)有兩方面無法克服的缺點(diǎn):siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解;進(jìn)入細(xì)胞siRNA的數(shù)量不受控制。針對這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達(dá)。

shRNA通過載體導(dǎo)入細(xì)胞后，利用細(xì)胞內(nèi)的酶切機(jī)制得到siRNA而最終發(fā)揮RNA干擾作用。shRNA最大的優(yōu)勢是利用載體上的抗生素標(biāo)記可以建立相對穩(wěn)定的長期基因沉默細(xì)胞株，或者通過病毒插入基因組中從而得到穩(wěn)定的基因沉默表達(dá)株。此外，載體上的抗生素篩選還可以排除未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以避免混雜的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的目標(biāo)基因mRNA干擾后繼的定量檢測結(jié)果。shRNA質(zhì)粒載體除了可以做長期基因沉默，還可重復(fù)使用[15]。

本實(shí)驗(yàn)綜合體內(nèi)表達(dá)shRNA設(shè)計(jì)原則，由專業(yè)人員在線設(shè)計(jì)，以確保設(shè)計(jì)的siRNA序列的有效性。本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)粒載體介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染效率高，穩(wěn)定性好，對細(xì)胞的和組織的毒副作用小，在細(xì)胞中持續(xù)長期抑制靶基因的表達(dá)，適合基因治療和長期研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以CXCR4為靶向的shRNA質(zhì)粒載體能夠有效下調(diào)CXCR4基因的表達(dá)，達(dá)到CXCR4基因沉默效應(yīng)，為下一部分實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2010-05-10 [修回日期]2010-07-14

編輯/張惠娟