牽引成骨中細(xì)胞因子的表達(dá)及作用

牽引成骨技術(shù)(distraction osteogenesis，DO)因其能在原位快速成骨而被稱為是一種內(nèi)源性組織工程技術(shù)(endogenous tissues engineer)。自1992年McCarthy首次將DO技術(shù)用于下頜骨畸形患者的治療以來，經(jīng)過十多年的基礎(chǔ)研究與臨床實(shí)踐，DO在顱頜面外科缺損修復(fù)重建中的臨床運(yùn)用越來越受到重視。然而，DO的某些并發(fā)癥(如骨再生不良、延遲愈合、不愈合)，特別是較長的療程及牽引裝置長時(shí)間留置于面部或口腔內(nèi)所引發(fā)的各種問題(如固定螺釘松脫、傷口感染、骨折等)成為臨床運(yùn)用和推廣該技術(shù)的瓶頸和主要障礙[1]。近年來，對(duì)DO中新骨形成的分子機(jī)制做了大量基礎(chǔ)性研究，證實(shí)牽張機(jī)械力引起了多種細(xì)胞因子基因的表達(dá)增加，提示DO過程中多種細(xì)胞因子影響著成骨細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的生物合成和礦化。本文就這方面的研究綜述如下。

1轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)

TGF-β是一組多功能蛋白多肽，廣泛存在于動(dòng)物正常組織細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，以骨組織和血小板中含量最為豐富，其在骨形成和骨重建中起著極其重要的作用。TGF-βs能促進(jìn)成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及前成骨細(xì)胞的增殖，同時(shí)能有效促進(jìn)膠原合成及非膠原細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá);此外，TGF-βs能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的合成和促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制因子TIMP-1的合成抑制細(xì)胞外基質(zhì)分子的降解[2]。

目前，對(duì)DO過程中TGF-β1的表達(dá)研究較為深入，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為TGF-β1在DO的整個(gè)過程中均有表達(dá)，只是表達(dá)水平不同;并且在不同時(shí)期表達(dá)部位也不同。Mehrara等[3]在鼠下頜DO實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在潛伏期末TGF-β1表達(dá)較未手術(shù)組增加2.5倍，牽張初期增加到正常水平的3倍，并且在整個(gè)牽張期都保持高水平，直至固定期第4周末才恢復(fù)到正常水平;潛伏期及牽張?jiān)缙赥GF-β1主要在截骨線周圍的炎癥細(xì)胞、成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)中表達(dá)增高;當(dāng)繼續(xù)牽引，則高表達(dá)于活性成骨細(xì)胞、新生成的血管及細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維;固定期TGF-β1表達(dá)僅局限于牽張間隙中的成骨細(xì)胞。Steinbrech等[4]發(fā)現(xiàn)TGF-β1隨牽張的進(jìn)行而持續(xù)表達(dá)，并伴有骨基質(zhì)的輕度礦化和膠原的活躍合成，而且TGF-β1及其受體的表達(dá)廣泛存在于皮質(zhì)切開的骨邊緣、骨膜、周圍軟組織和炎細(xì)胞，以及中央纖維形成區(qū)的成纖維細(xì)胞和各區(qū)域的成骨細(xì)胞。陳勇等[5]也證實(shí)TGF-β1的表達(dá)貫穿下頜骨DO的全過程，且TGF-β1mRNA及其蛋白表達(dá)在牽引早期達(dá)到高峰，此后逐漸減弱，其不同時(shí)期表達(dá)部位與上述相似。表明牽張機(jī)械力刺激可促進(jìn)TGF-β1的合成和分泌，推測(cè)其在牽引成骨中是成骨細(xì)胞遷移、分化、胞外基質(zhì)合成、血管形成的重要調(diào)節(jié)因子。

然而，外源性TGF-β1對(duì)DO中新骨形成作用的研究結(jié)果不完全相同。Ozkan等[6]發(fā)現(xiàn)外源性TGF-β1增加牽張區(qū)新生骨組織的密度和強(qiáng)度;而Rauch等[7]在兔DO實(shí)驗(yàn)中局部應(yīng)用TGF-β1，結(jié)果對(duì)成骨量及成骨密度均無影響，僅增加了骨痂區(qū)的纖維組織。Seiadini等[8]在對(duì)脛骨節(jié)段性DO研究中，給予外源性重組人TGF-β，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和生理鹽水組骨明顯、連續(xù)、穩(wěn)定、礦化均勻，而注入TGF-β組結(jié)果則相反，且隨劑量的增加軟骨和軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，表現(xiàn)出對(duì)成骨起抑制作用。表明TGF-βs促進(jìn)成骨作用在體內(nèi)可能存在一精確的調(diào)節(jié)機(jī)制，如何利用外源性TGF-βs來促進(jìn)DO中的骨組織的再生有待進(jìn)一步研究。

2骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)

BMPs是一種疏水酸性糖蛋白，為TGF-β超家族成員之一，目前已發(fā)現(xiàn)的有BMPl-12，其作用具有濃度依賴性，低濃度時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞趨化和增殖，高濃度時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞分化和骨形成。Sato等[9]在鼠長骨DO實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在截骨后4天，BMP-2、-4mRNA可在骨膜下未成熟骨痂中的軟骨前體細(xì)胞中檢測(cè)到;截骨后7天，BMP-2、-4mRNA恢復(fù)到術(shù)前水平;當(dāng)牽引開始后，BMP-2、-4mRNA在纖維區(qū)的軟骨細(xì)胞，骨細(xì)胞和它們的前體細(xì)胞中明顯表達(dá)，約是骨切開時(shí)表達(dá)量的20倍，在整個(gè)牽引期維持較高水平;至固定期BMP-2、-4表達(dá)消失;而BMP-6、-7在DO中的表達(dá)情況與BMP-2、-4的表達(dá)不同，牽張初期，BMP-6僅在成軟骨細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)得到，隨著牽張的進(jìn)行，BMP-6 mRNA表達(dá)漸降低，至固定期不表達(dá);BMP-7在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均未被檢測(cè)到。推測(cè)BMP-6在軟骨成骨階段可能發(fā)揮著一定的作用，BMP-7對(duì)其成骨無明顯影響。Rauch等[10]在對(duì)兔脛骨施行牽引成骨術(shù)時(shí)也證實(shí)，在潛伏期，BMP-2、-4表達(dá)增加，尤其在骨膜的間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞十分明顯;在牽引期，BMP-2、-4在成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中表達(dá)持續(xù)升高;當(dāng)牽引停止后，表達(dá)逐漸下降;但Rauch等發(fā)現(xiàn)BMP-7的表達(dá)與BMP-2、-4的表達(dá)同步，且表達(dá)的部位也基本類似。這可能與動(dòng)物模型的建立、檢測(cè)手段和檢測(cè)試劑等因素有關(guān)。Khanal[11]進(jìn)行牽引區(qū)新生骨組織免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)，潛伏期BMP-2、-4， Smads 1、5、 8的表達(dá)僅輕微增加，牽引期表達(dá)顯著增加而進(jìn)入固定期則逐漸減弱，認(rèn)為BMP信號(hào)通路在將機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)錄為生物學(xué)效果中起重要作用。

目前，已證實(shí)BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12均有促進(jìn)新骨形成的作用，其中，以BMP-2促進(jìn)新骨形成作用最強(qiáng)[12-18]。這些骨形態(tài)發(fā)生蛋白之間也可能存在協(xié)同作用，有文獻(xiàn)報(bào)道[19-20]重組BMP-2與BMP-7的聯(lián)合基因治療較單一應(yīng)用其中一個(gè)更能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成骨。但目前仍然不知道在牽引過程中產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力是如何激活機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)信號(hào)，尚需進(jìn)一步研究。

3血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)

血管內(nèi)皮生長因子也稱血管滲透因子(vascular permeability factor，VPF)，最初是在腫瘤細(xì)胞分泌物中發(fā)現(xiàn)的，是一種糖基化分泌性多肽因子，具有維持血管正常狀態(tài)和完整性，增加血管通透性，誘導(dǎo)血管發(fā)生，并促進(jìn)血管生成的作用。Warren等[21]在鼠下頜骨DO實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在截骨后5～7天 VEGFmRNA的表達(dá)增加，在牽引1周左右達(dá)高峰，其表達(dá)貫穿整個(gè)牽引期及固定期，在牽引帶成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上有高濃度的VEGF表達(dá)及強(qiáng)烈的血管生成反應(yīng)。Byun[22]在狗單側(cè)下頜骨DO過程中檢測(cè)牽引區(qū)VEGF和其兩種受體Flt-1、Flk-1，發(fā)現(xiàn)牽引7天后牽引區(qū)成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中VEGF和其受體表達(dá)明顯增加，并在成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中維持14天。牽引28天后VEGF和VEGFR-1在成骨細(xì)胞中表達(dá)減弱，牽引區(qū)細(xì)胞中無VEGFR-2表達(dá)。在整個(gè)觀察期VEGFR-1明顯強(qiáng)于VEGFR-2的表達(dá)。Sojo[23]研究發(fā)現(xiàn)VEGF在牽引區(qū)新生成骨的前部靠近新生成骨的周邊的成骨細(xì)胞表達(dá)，而BMP-2、-4在肥大的軟骨細(xì)胞中表達(dá)。在同一標(biāo)本中VEGF表達(dá)區(qū)域比BMP-2、-4表達(dá)區(qū)域離骨干遠(yuǎn)，因此認(rèn)為在成骨之前先有血管生成。Casap[24]在兔下頜骨牽引一側(cè)牽引區(qū)應(yīng)用VEGF后發(fā)現(xiàn)應(yīng)用VEGF部位的新骨生成明顯增加，因此，認(rèn)為VEGF對(duì)新骨形成具有積極的作用。但Eckardt等[25]在對(duì)兔牽引動(dòng)物模型中局部導(dǎo)入VEGF或VEGF拮抗劑，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)對(duì)新骨形成有明顯影響。推測(cè)可能是因?yàn)闄C(jī)械牽張已刺激VEGF等生長因子的大量產(chǎn)生，導(dǎo)入的外源性VEGF或VEGF拮抗劑不足以發(fā)揮作用。另外，導(dǎo)入VEGF的時(shí)機(jī)、劑量及處理方式等都可能影響新骨形成。

4堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)

bFGF是一種25kD的多肽，包括至少19個(gè)密切相關(guān)的單肽，能促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)軟骨和骨基質(zhì)合成，與血管內(nèi)皮生長因子協(xié)同作用，可促進(jìn)血管再生，從而促進(jìn)骨生成。Yeung等[26]研究bFGF在牽引過程中的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，在延遲期、牽引期、固定期bFGF均有不同程度的表達(dá)。在潛伏期，骨膜和骨髓質(zhì)區(qū)的類纖維原細(xì)胞bFGF表達(dá)較明顯，新形成的成骨細(xì)胞也有bFGF的表達(dá);牽引期，正在形成中的骨小梁成骨細(xì)胞bFGF有非常強(qiáng)的表達(dá)。在新形成骨小梁和纖維組織中，成骨細(xì)胞密度比相鄰區(qū)域明顯增高，bFGF的表達(dá)也更明顯。在固定期bFGF的表達(dá)比牽引期明顯減弱。劉人愷等[27]在山羊顱骨縫DO實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)山羊顱骨縫在受到牽張力作用后bFGF有高水平表達(dá)，以牽張結(jié)束當(dāng)天與第2周最為顯著，主要定位于成纖維樣細(xì)胞與成骨細(xì)胞，隨著固定時(shí)間的延長其表達(dá)逐漸減弱。

應(yīng)用外源性bFGF可刺激骨痂形成，促進(jìn)骨折修復(fù)和再生、移植骨愈合及骨缺損修復(fù)。Okazaki等[28]對(duì)兔脛骨行牽引成骨，牽引結(jié)束后，局部注入200μg bFGF，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)牽引區(qū)骨形成。在牽引結(jié)束后2～5周，發(fā)現(xiàn)骨礦化量明顯增加，提示在骨牽引的固定期，外源性bFGF的應(yīng)用可以縮短骨延長時(shí)間。將bFGF注入兔脛骨近端骺板后，血管由鄰近干骺端長入，加速骨前體細(xì)胞的侵入及軟骨骨化。朱永云等[29]將外源性bFGF注射到兔下頜骨牽引區(qū)，顯示牽引區(qū)新骨生成速度和數(shù)量高于對(duì)照組，認(rèn)為局部導(dǎo)入外源性bFGF可能有促進(jìn)下頜骨牽引成骨的作用，從而為縮短DO療程和減少牽引后復(fù)發(fā)回彈提供了一種可能的途徑。

5胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)

胰島素樣生長因子是一類對(duì)機(jī)體生長發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用并具有胰島素樣代謝效應(yīng)的因子，目前已發(fā)現(xiàn)有IGF-1和IGF-2兩種異構(gòu)體，分別為含有70個(gè)和67個(gè)氨基酸的單鏈多肽。IGF-1可由成骨細(xì)胞產(chǎn)生并以自分泌方式刺激成骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成，IGF-2的生理作用與IGF-1相似但作用較弱。Eingartner等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在DO過程中IGF-l的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的時(shí)間性。在牽引早期，血漿中IGF-1水平最先升高，其后牽引帶和周圍骨組織中IGF-1水平開始升高，這可能是由于受牽引力影響，周圍軟組織最先釋放IGF-1，導(dǎo)致血液中濃度升高的結(jié)果。而Meyer等[31]檢測(cè)牽引成骨時(shí)兔血清IGF-1含量發(fā)現(xiàn)，在骨切開后IGF-1血清濃度下降，但牽引期其濃度并無明顯升高。Yates等[32]研究IGF-1在豬下頜DO早期的作用，發(fā)現(xiàn)牽引早期骨膜中IGF-1升高明顯，牽引帶僅有少量礦化骨質(zhì)形成;牽引結(jié)束后，IGF-1恢復(fù)到正常水平，牽引帶有大量礦化骨形成。說明IGF-1可能在牽引早期發(fā)揮重要作用。王志國等[33]在研究局部應(yīng)用IGF-1對(duì)兔下頜骨DO的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物在X線片上無明顯差異;在組織學(xué)觀察上，兩組在牽張間隙內(nèi)均見到有大量新生骨小梁生成，骨小梁排列方向與牽引方向一致;組織學(xué)分級(jí)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組新骨生成數(shù)量僅比對(duì)照組多2.4%，但統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果表明兩組未見顯著差異。Schrnid[34]研究發(fā)現(xiàn)只有在機(jī)體缺乏IGF時(shí)，外源性IGF對(duì)成骨細(xì)胞的分化與增殖才有促進(jìn)作用。在骨切開術(shù)和隨后的牽引過程中，局部組織會(huì)產(chǎn)生較高濃度的IGF-1，這時(shí)候?qū)胪庠葱訧GF-1顯得多余。另外，聯(lián)合應(yīng)用生長因子可能比單獨(dú)應(yīng)用某一種生長因子更有效。

綜上所述，在牽引成骨術(shù)中牽張機(jī)械力能促進(jìn)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，其參與了牽引區(qū)新骨形成及礦化的調(diào)節(jié)，這為闡明牽引成骨的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ);但這些細(xì)胞因子表達(dá)的時(shí)間順序及之間的相互作用還尚不清楚，此外，對(duì)于外源性細(xì)胞因子應(yīng)用的時(shí)間、途徑及劑量還需深入研究。相信隨著對(duì)牽引成骨分子機(jī)制的研究深入，必將對(duì)臨床應(yīng)用和研究產(chǎn)生重要的指導(dǎo)意義，推動(dòng)牽引成骨的廣泛應(yīng)用。

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[收稿日期]2010-06-07 [修回日期]2010-07-20

編輯/李陽利