糖尿病創(chuàng)面表皮干細(xì)胞增殖分化相關(guān)蛋白的研究

[摘要]目的:表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells，ECMs)是皮膚發(fā)生、修復(fù)、重塑的關(guān)鍵性因素。研究糖尿病創(chuàng)面中ECMs增殖分化相關(guān)蛋白-角蛋白19(keratin19，K19)及β1整合素(β1-integrin)的表達(dá)，探討ECMs在糖尿病創(chuàng)面修復(fù)中的作用及意義。方法:采用免疫組化SP法檢測(cè)角蛋白19及β1整合素在各年齡組糖尿病患者創(chuàng)面及正常人全厚皮膚組織中的表達(dá)水平。結(jié)果:糖尿病患者創(chuàng)面各組角蛋白19及β1整合素的陽(yáng)性表達(dá)分別為81.73±15.31、22.32±5.42，均低于正常人組(P<0.05)。結(jié)論:糖尿病患者創(chuàng)面皮膚組織中ECMs數(shù)量少、增殖分化能力差可能是導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面難以修復(fù)的重要原因之一。

[關(guān)鍵詞]表皮干細(xì)胞;糖尿病創(chuàng)面;角蛋白19;β1整合素;免疫組化

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)08-1171-02

Study on related protein of proliferation of epidermal stem cells in diabetic wound

LI Yong-tao1，WANG Xi-mei1，QIAO Xiao-jun2，YUAN De-pin1，TANG YIN-ke1

(1.Department of Plastic Surgery， 2 Department of Neuro Surgery，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，Henan，China)

Abstract:ObjectiveEpidermal stem cells are the optimizing key factors in processing of skin endermic，repair and remoulding.To investigate the expression of related protein of proliferation of epidermal stem cells -keratin19，β1-integrin in diabetic wound， and discuss epidermal stem cells' role and significance in diabetic wound.MethodsSP immunohistochemical method was used to detect the expressions of keratin19 and β1-integrin in different age group of diabetics wound and normal skin tissue. ResultsThe positive rates of keratin19 and β1-integrin in different age group of diabetics'wound were 81.73±15.31，22.32±5.42 and were lower compared with the group of normal skin tissue(P<0.05).ConclusionThe decreased amount and the low proliferation and differentiation capacity of ECMs may be one of the important mechanisms of different recovering diabetic wound.

Key words: epidermal stem cells;diabetic wound;keratin19;β1-integrin;immunohistochemistry

表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells，ECMs)作為皮膚組織具有多向分化潛能的干細(xì)胞，是皮膚發(fā)生、創(chuàng)面修復(fù)和重塑的關(guān)鍵。近年來(lái)常采用具有相對(duì)較高特異性的角蛋白19及β1整合素同時(shí)染色陽(yáng)性來(lái)標(biāo)記[1-2]。糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者皮膚易受損傷， 且損傷后創(chuàng)面愈合延遲或不愈合。DM 創(chuàng)面難愈的機(jī)制很復(fù)雜， 目前對(duì)其研究頗多[3-4]。但是，從表皮干細(xì)胞角度去探討糖尿病創(chuàng)面難愈的研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)糖尿病患者和正常人全厚皮膚組織中角蛋白19和β1整合素的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討表皮干細(xì)胞在糖尿病創(chuàng)面中的表達(dá)及其在正常皮膚中的差異，推測(cè)表皮干細(xì)胞對(duì)糖尿病創(chuàng)面修復(fù)的影響。

1材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源:標(biāo)本來(lái)自2008.7～2010.3鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)患者。其中糖尿病患者創(chuàng)面手術(shù)后剩余全厚皮膚組織30例，男12例，女18例，年齡45歲～60歲，病程1年～10年，分別取材于足部、小腿;正常皮膚為美容手術(shù)切除的全厚皮膚組織，共30例，男10例，女20例，年齡35～60歲。所有患者均無(wú)皮膚疾病、結(jié)締組織病、傳染病、惡性腫瘤和其他重要臟器疾病，術(shù)前無(wú)放療、激光治療及免疫治療史。標(biāo)本用10%的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。

1.2 主要試劑及方法:角蛋白19抗體、β1整合素抗體、免疫組化SP試劑盒、DAB 顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照SP 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。角蛋白19及β1整合素一抗工作濃度均為1:100。取已知陽(yáng)性對(duì)照切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):在400倍光鏡下觀察免疫組化結(jié)果，β1整合素細(xì)胞膜染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，角蛋白19細(xì)胞漿染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。兩組均見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，隨機(jī)選取20個(gè)視野，每視野觀察100個(gè)細(xì)胞，記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS16.0 軟件包對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以x±s形式表示，兩組之間比較采用χ2檢驗(yàn)，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

角蛋白19陽(yáng)性細(xì)胞胞漿均呈棕黃色，β1整合素陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色。兩組均見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，糖尿病組兩者的陽(yáng)性表達(dá)分別為81.73±15.31、22.32±5.42，均明顯低于正常人組的146.88±38.65、56.12±15.34，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

糖尿病患者容易并發(fā)皮膚潰瘍或創(chuàng)傷后難以愈合，常常成為糖尿病患者致死或致殘的重要原因之一。DM 創(chuàng)面難愈的機(jī)制很復(fù)雜， 目前對(duì)其研究頗多，主要還是從糖代謝紊亂、細(xì)胞間相互作用、微血管形成、表皮生長(zhǎng)因子受體改變、蛋白酶、表皮細(xì)胞增殖障礙等方面研究。謝挺等[5]研究結(jié)果表明，在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，創(chuàng)面的再上皮化主要依賴于表皮細(xì)胞增殖等生物學(xué)行為的正常發(fā)揮。最近的研究表明ESCs作為皮膚組織的特異性干細(xì)胞，具有無(wú)限增殖和多向分化潛能，可以增殖分化為各種表皮細(xì)胞，是皮膚組織發(fā)生、創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)鍵性細(xì)胞[6-7]。近年來(lái)角蛋白19和β1整合素是公認(rèn)的ECMs特異性相對(duì)較高的標(biāo)記物[8]。其中，角蛋白是一種表皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，在表皮中具有重要的保護(hù)作用，角蛋白19是ESCs的特異性標(biāo)志物[9]，在干細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性，在分化細(xì)胞中表達(dá)陰性。而整合素是一類位于細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體家族分子，ESCs是整合素表達(dá)水平最高的一類細(xì)胞，β1整合素高表達(dá)于ESCs的表面，在ESCs的增殖分化過(guò)程中起著非常重要的作用，不但參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，還影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)對(duì)糖尿病患者和正常人全厚皮膚組織中角蛋白19和β1整合素的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察糖尿病患者和正常人皮膚中ECMs的數(shù)量變化和增殖分化能力方面的差異，探討其與糖尿病創(chuàng)面難愈之間的關(guān)系。通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在糖尿病創(chuàng)面中角蛋白19和β1整合素的的陽(yáng)性表達(dá)明顯低于正常人對(duì)照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中角蛋白19和β1整合素在糖尿病患者創(chuàng)面皮膚中表達(dá)降低，表明糖尿病患者創(chuàng)面皮膚中ESCs與正常人皮膚相比數(shù)量減少、增殖分化能力明顯滯后，這可能是導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面難愈或延遲愈合的重要因素之一。

糖尿病創(chuàng)面的治療除了積極控制血糖外，創(chuàng)面的再上皮化對(duì)創(chuàng)面愈合極為重要[10]。由于ESCs具有多向分化潛能、來(lái)源豐富、取材容易，以ESCs為種子細(xì)胞，培養(yǎng)理想的組織工程皮膚，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，有可能為糖尿病及各種嚴(yán)重創(chuàng)傷等所致的難愈性創(chuàng)面的治療提供更為有效的手段。本研究也為臨床應(yīng)用ESCs治療糖尿病創(chuàng)面難愈或不愈提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Janes SM，Lowell S，Hutter C.Epidermal stem cells[J]. Pathol，2002，197(4):479-491.

[2]藍(lán)蔚，劉德伍，毛遠(yuǎn)桂.表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12 (25):4936-4940.

[3]Chbinou N， Frenette J.Insulin dependent diabetes impairs the inflammatory response and delays angiogenesis following A chillestendon injury[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，286(5):952-957.

[4]Mashat HA， Kandru S，Liu R， et al. Diabetes enhances mRNA levels of proapop to ticgenes and caspase activity，which contribute to impaired healing[J]. Diabetes，2006，55(2):487-495.

[5]謝挺，陸樹(shù)良.糖尿病大鼠皮膚組織表皮細(xì)胞增殖相關(guān)事件的研究[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(6):541-544.

[6]Janes SM，Lowell S，Hutter C.Epidermal stem cells[J]. J Pathol，2002，197(4):479-491.

[7]付小兵，孫曉慶，孫同柱等.表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)誘導(dǎo)皮膚干細(xì)胞分化加速受創(chuàng)表皮再生的研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2002，16(1):31-35.

[8]李海紅，付小兵，周崗，等.細(xì)胞角蛋白在皮膚中的表達(dá)[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2005，22: 834.

[9]呂春榮，葉紹輝，關(guān)偉軍，等.表皮干細(xì)胞的鑒定方法[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(43): 8767-8570.

[10]Bitto A， Minutoli L，ltavilla D，et al. Simvastatin enhances VEGF production and ameliorates impaired wound healing in experimental diabetes[J]. Pharmacol Res，2008，57(2):159-169.

[收稿日期]2010-05-16[修回日期]2010-07-14

編輯/張惠娟