單核巨噬細胞集落刺激因子對人皮膚成纖維細胞增殖及膠原合成的影響

[摘要]目的:研究單核巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor， GMCSF)對人皮膚成纖維細胞增殖及膠原合成的影響，探討其促進創(chuàng)面愈合的機制并為臨床準確定量應用該因子促進創(chuàng)面愈合提供理論依據(jù)。方法:分別應用濃度為0、25、50、75、100、150ng/ml GMCSF培養(yǎng)液孵育離體培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞，作用24h后四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細胞的活性。選擇最適濃度GMCSF干預細胞，用流式細胞儀檢測成纖維細胞的周期變化;應用ELISA檢測上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原合成情況。結(jié)果:GMCSF在濃度為25～100ng/ml之間對人皮膚成纖維細胞有明顯的促增殖作用，其中以50/ml最為顯著;成纖維細胞在最適濃度GMCSF干預24h后，細胞大多處于DNA合成前期和合成期;與空白組比較，GMCSF組Ⅰ、Ⅲ型膠原分泌明顯增加(P<0.01)，且Ⅰ、Ⅲ型膠原比值下降(P<0.01)。結(jié)論:GMCSF在濃度為25～100ng/ml對人皮膚成纖維細胞有明顯的促增殖作用，且能刺激成纖維細胞合成大量Ⅰ、Ⅲ型膠原，這可能是其加速創(chuàng)面愈合的機制之一。

[關(guān)鍵詞]單核巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF);成纖維細胞;創(chuàng)面愈合;細胞增殖

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)08-1149-04

Effect of Granulocyte / Macrophage Colony-Stimulating Factor(GMCSF)on cell proliferation and synthesis of collage in human derma fibroblast

LI Xiao-guang，F(xiàn)ANG Yong，YAO Min，HU Xiao-hui，XU Peng，YU Wei-rong，NI Tao

(Department of Burns Plastic Surgery，the Third Hospital，School of Medicine， Shanghai Jiaotong University，Shanghai 201900，China)

Abstract: ObjectiveTo investigate the effects of Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor(GMCSF)on cell proliferation and synthesis ofcollage in cultured human derma fibroblasts.To explore the mechanism by which GMCSF promotes wound healing and provide a theory basis for application GMCSF at the accurate quantification in the clinical.MethodsIn vitro human derma fibroblasts in good status were incubated in different concentration(0、25、50、75、100、150ng/ml) of GMCSF culture medium. After 24 hours， cel1 activity was detected with MTT.Cell cycle of fibroblasts interfered with the best concentration were measured by flow cytometry.And the secretion of typeⅠand Ⅲ collagen in supernatant was measured by enzyme linked immunosorbant assay (ELISA). ResultsGMCSF is effective to induce the proliferation of fibroblasts between 25ng/ml to 100ng/ml， especially at the concentration 50ng/ml.The fibroblasts interfered with optimum concentration for 24 hours were in pre-and synthetic DNA synthesis period. Compared with the blank group， the supernatant of the typeⅠand Ⅲ collagen were raised remarkably in GMCSF group(P<0.01) and decreased ratio of the typeⅠto the type Ⅲ collagen(P<0.01).ConclusionGMCSF is effective to induce the proliferation of fibroblasts between 25ng/ml to 100ng/ml and can up-regulate directly the expression of typeⅠand Ⅲ collagen in human derma fibroblast，which may be one of the mechanisms that GMCSF accelerates the wound healing.

Key words:Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor(GMCSF); fibroblast; wound healing; cell proliferation

創(chuàng)面愈合是一個復雜而又高度協(xié)調(diào)的過程，包括炎癥反應、組織細胞增殖和組織重建三個互相重疊但又具有不同特點的階段。成纖維細胞作為創(chuàng)面愈合過程中的主要修復細胞在此修復過程中起著重要的作用。它可以通過分泌多種細胞因子，還能合成和分泌膠原、透明質(zhì)酸、連接蛋白等細胞外基質(zhì)促進創(chuàng)面的愈合。既往研究表明，單核巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor，GMCSF)具有刺激免疫干細胞增殖的作用。GMCSF作為重要的免疫增強劑應用于化療放療后以及嚴重感染等免疫低下患者，取得了良好的效果[1]。近年來的研究表明，GMCSF可通過刺激和編碼其他炎癥因子(MCP-1， MIP-1)及生長因子(VEGF、FGF、PDGF等)的基因表達和蛋白質(zhì)合成，通過這些因子作用于修復細胞，從而達到促進創(chuàng)面愈合的效應 [2-3]，但其具體機制尚不清楚。本實驗以人皮膚成纖維細胞為研究對象，觀察外源性GMCSF對人皮膚成纖維細胞增殖和膠原表達的影響，從基礎方面為臨床準確定量應用GMCSF促進創(chuàng)面愈合提供理論依據(jù)并探討其促進創(chuàng)面愈合的機制。

1材料和方法

1.1 材料和儀器:DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco，美國);四甲基偶氮唑藍MTT及DMSO(上海鼎國生物技術(shù)有限公司);單核巨噬細胞集落刺激因子(欣百諾生物有限公司);Ⅰ型和Ⅲ型膠原ELISA試劑盒(RD，美國);FACSCalibur 流式細胞儀(BD，美國);細胞培養(yǎng)箱(Heal Force);離心機(Beckman)。

1.2 方法

1.2.1人皮膚成纖維細胞的原代分離與培養(yǎng):取我院泌尿外科兒童包皮環(huán)切術(shù)后包皮(患者知情同意)進行原代分離培養(yǎng)及鑒定[4]。本實驗選用第4代生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的人皮膚成纖維細胞細胞用于研究。

1.2.2 MTT法檢測人皮膚成纖維細胞增殖活力:收集處于對數(shù)增殖期的第4代人皮膚成纖維細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，血細胞計數(shù)板計數(shù)后，以2×103個/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)24h后，小心吸棄培養(yǎng)液，每空加入100μl無血清培養(yǎng)液平衡12h。然后分別加入含有GMCSF濃度為0，25，50，75，100，150ng/ml無血清的DMEM培養(yǎng)液，每組8個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。每空加入MTT(5mg/ml)20μl。37℃，5%CO2繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入DMSO150μl，振蕩10min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定出各孔的吸光度(A)值。

1.2.3 流式細胞儀檢測人皮膚成纖維細胞周期:取對數(shù)生長期細胞，加入含有GMCSF濃度為75ng/ml的無血清培養(yǎng)液，實驗設GMCSF組及空白組，培養(yǎng)24h后，血細胞計數(shù)版計數(shù)，制成1×106個/ml細胞懸液，1 000r/min離心10min，棄上清，加入PBS洗一次，加入4℃的70%乙醇固定，4℃冰箱保存。然后取出所固定的細胞，離心棄去乙醇，用PBS重懸細胞，離心，棄上清，用PI染液(含RNAase酶)，4℃避光染色30 min。用流式細胞儀測定人皮膚成纖維細胞倍體。采用多參數(shù)細胞分析軟件處理，對樣本進行DNA含量及細胞周期分析。

1.2.4 夾心ELISA法檢測人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原分泌:取對數(shù)生長期人皮膚成纖維細胞，實驗設GMCSF組及空白組。其中GMCSF組加入濃度為75ng/ml的無血清培養(yǎng)液，空白組加入相應量PBS溶液。各組細胞孵育24h后終止培養(yǎng)。取終止培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，離心去沉淀，取上清。Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量測定按照試劑盒說明書操作，每組設3個復孔，在450nm波長酶標儀上測各孔吸光度值。根據(jù)標準曲線換算成Ⅰ、Ⅲ型膠原的濃度。

1.2.5統(tǒng)計學分析:所有計量資料均以x±s表示，采用SPSS11.0軟件進行方差分析，以α=0.05作為水準，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。各組間采用SNK-q法檢驗。

2結(jié)果

2.1 人皮膚成纖維細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)觀察:人皮膚成纖維細胞在體外為貼壁生長型細胞，組織塊接種后第5天可見細胞萌出，到第10天可見大量細胞游出(圖1A)。細胞界限清楚，胞體較大，以梭形為主，也可見不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2～3個長短不一的突起，胞核呈類圓形或橢圓形居中。待細胞互相融合后，細胞排列緊密，多呈放射狀、柵欄狀生長見(圖1B)。

2.2 GMCSF對體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞增殖的影響:各濃度組測定的MTT值如下表所示(見表1)，對其進行方差分析(見表2)，結(jié)果示:F=27462，P<0.001，因此可以認為各個處理組總體均數(shù)不全相等，即不同濃度的GMCSF對人皮膚成纖維細胞具有促進增殖的作用。同時對各組間采用SNK-q法兩兩比較，認為:低濃度的rhEGF即可起到促增殖作用，但是對于150ng/ml濃度組與空白組比較，其作用差異無統(tǒng)計學意義，在25～100ng/ml之間均有較明顯的促進人皮膚成纖維細胞增殖的作用(P<0.05)，以50ng/nl作用最為顯著(P<0.05)。

2.3 流式細胞檢測結(jié)果:流式細胞儀檢測人皮膚成纖維細胞DNA含量結(jié)果顯示:與空白組比較，濃度為50ng/ml的GMCSF組增殖期(S-G2-M)成纖維細胞所占百分數(shù)明顯升高，細胞分化良好，無異常分化現(xiàn)象，提示經(jīng)GMCSF處理24h后的成纖維細胞大多處于合成前期和合成期，具有較強的生長潛力。各組的增殖期百分數(shù)分別為，空白組:G0-G1期60.36%，S期27.57%，G2-M期12.07%;GMCSF組:G0-G1期40.28%，S期36.54%，G2-M期23.18%。

2.4 GMCSF對體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞Ⅰ型和Ⅲ型分泌的影響:人皮膚成纖維細胞在處理24h后，收集細胞，通過ELISA檢測Ⅰ型和Ⅲ型膠原分泌情況，結(jié)果示(見表3):與空白組比較，GMCSF組上清液Ⅰ型和Ⅲ型膠原分泌水平明顯增高(P<0.01)，Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原的比值明顯降低(P<0.01)。

3討論

創(chuàng)面愈合是一個復雜而有序的病理過程，是多種修復細胞(如表皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等)、細胞生長因子(如血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、GMCSF等)及細胞外基質(zhì)等因素相互作用的結(jié)果。既往研究認為，生長因子因具有多效性、高效性、網(wǎng)絡性等特點在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)[2]，GMCSF參與調(diào)控皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合過程中的多個環(huán)節(jié)而備受關(guān)注。

單核巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)是一種分子量約為22KD的多功能生長因子，具有前炎癥介質(zhì)的作用。在創(chuàng)面愈合中，GMCSF對炎癥細胞和組織修復細胞間相互作用進行調(diào)控，其生物學作用主要表現(xiàn)為誘導中性粒細胞和巨噬細胞成熟和遷移、刺激和編碼其他炎癥因子(MIP-1， MCP-1)及細胞生長因子(表皮細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子、成纖維細胞生長因子等)的基因表達和蛋白質(zhì)合成通過這些因子作用于修復細胞，從而達到促進創(chuàng)面愈合的效應。

在創(chuàng)面愈合過程中，創(chuàng)面上的GMCSF主要來源于成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、上皮細胞以及炎癥細胞(如中性粒細胞和巨噬細胞)，通過自分泌又作用于這些細胞[5-6]。本研究組在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，GMCSF基因敲除的小鼠創(chuàng)面愈合率明顯下降[7]。在糖尿病小鼠創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)[3，8]:創(chuàng)傷早期，糖尿病小鼠創(chuàng)面表達GMCSF的量較正常小鼠下降了50%。外用GMCSF可通過增加創(chuàng)面促炎性因子(白介素-6)及趨化蛋白(MCP-1)的表達，增加炎性細胞(中性粒細胞和巨噬細胞)的浸潤，促進創(chuàng)面修復細胞(如上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞等)的增殖，從而有利于糖尿病創(chuàng)面的愈合。本實驗從基礎方面研究表明，GMCSF在濃度為25～100ng/ml之間都可以刺激成纖維細胞的增殖，以濃度為50ng/ml最顯著。且在該濃度作用成纖維細胞后，其G0-G1期細胞所占百分率下降，S和G2-M期細胞所占百分率明顯增高，推測其作用機制可能是通過促使靜止態(tài)的G0-G1期細胞活躍而向S和G2-M期轉(zhuǎn)變，使DNA合成量增加從而促進成纖維細胞的增殖。

在創(chuàng)傷愈合過程中，成纖維細胞是主要的修復細胞，其所合成的膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，而膠原的代謝結(jié)果直接影響創(chuàng)面修復的質(zhì)量。膠原可以為創(chuàng)面上皮化提高支架，膠原合成后，上皮細胞才能沿著膠原支架爬行，覆蓋創(chuàng)面。正常皮膚軟組織中膠原含量以I、Ⅲ型為主，Ⅲ型占總膠原的10%～20%。I型膠原主要存在于成熟的組織中，而Ⅲ型則是一種新合成的膠原，決定著膠原纖維的直徑大小和彈性好壞[9]。I、Ⅲ型膠原比值降低則提示新生膠原增加。本實驗研究結(jié)果表明，與空白組比較，GMCSF組I、Ⅲ型膠原含量均明顯升高，但I型與Ⅲ型膠原比值降低。提示GMCSF明顯能增強人皮膚成纖維細胞的增殖速度和膠原合成能力。

目前GMCSF作為創(chuàng)面外用藥雖然已經(jīng)應用于臨床[10-11]，但是對于使用多少濃度才能夠最大限度促進創(chuàng)面的愈合尚存在爭議，對于促進創(chuàng)面愈合的詳細機制也尚未完全清楚。本研究從細胞水平確定了GMCSF對人皮膚成纖維細胞促增殖作用的最適濃度，為臨床準確用藥提供了可靠的依據(jù);并提示GMCSF促進成纖維細胞增殖及膠原的表達為其加速創(chuàng)面愈合的機制之一。至于GMCSF通過何種機制促進人皮膚成纖維細胞的增殖及膠原表達，這將有待于下一步深入的研究。

[參考文獻]

[1]Da Costa RM，Ribeiro Jesus FM，Aniceto C，et al.Randomized， double-blind， placebo-controlled， dose- ranging study of granulocyte-macrophage colony stimulating factor in patients with chronic venous leg ulcers[J]. Wound Repair Regen，1999，7(1):17-25.

[2]Mann A，Niekisch K，Schirmacher P，et al. Granulocyte macrophage colony- stimulating factor is essential for normal wound healing[J].J InvestigDermatol Symp Proc，2006，11(1):87-92.

[3]Fang Y，Shen J，Yao M，et al.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances wound healing in diabetes via upregulation of proinflammatory cytokines[J].Br J Dermatol，2010，162(3):478-486.

[4]Luo JM，Wang L.Expression of proteinase activated receptors from primary cultured human dermal fibroblast[J].Anat Res，2007，29(1):33-37.

[5]Braunstein S，Kaplan G，Gottlieb AB，et al.GM-CSF activates regenerative epidermal growth and stimulates keratinocyte proliferation in human skin in vivo[J].J Invest Dermatol，1994，103:601- 604.

[6]Breuhahn K，Mann A，Muller G，et al.Epidermal overexpression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces both keratinocyte proliferation and apoptosis [J]. Cell Growth Differ，2000，11:111-121.

[7]Fang Y，Gong SJ，Xu YH，et al.Impaired cutaneous wound healing in granulocyte/macrophage colony-stimulating factor knockout mice[J]. Br J Dermatol，2007，157(3):458-465.

[8]程瑞杰，方勇，俞為榮，等. 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子對糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的作用[J].上海交通大學學報·醫(yī)學版，2007，27(4):415-418.

[9]Chung JH，Seo JY，Choi HR，et a1. Modulation of skincollagen metabolism in aged and photoaged human skin in vivo[J].J Invest Dermato1，200l，l17(5):l2l8-1224.

[10]Wang ZY，Zhang Q，Liao ZJ，et al.Effect of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor on wound healing in patients with deep partial thickness burn[J]. Zhonghua Shaoshang Zazhi，2008，24(2):107-110.

[11]Zhang L，Chen J，Han C.A multicenter clinical trial of recombinant human GM-CSF hydrogel for the treatment of deep second-degree burns[J]. Wound Repair Regen，2009，17(5):685-689.

[收稿日期]2010-04-10 [修回日期]2010-06-10

編輯/張惠娟