體外培養(yǎng)兔鼻軟骨細(xì)胞在靜態(tài)牽張應(yīng)力作用下增殖活性變化及其臨床意義

[摘要]目的:探討體外培養(yǎng)的不同年齡兔鼻軟骨細(xì)胞在5kPa靜態(tài)牽張應(yīng)力作用下增殖活性的變化，從而為鼻軟骨牽張術(shù)前正畸矯治唇腭裂伴發(fā)鼻畸形提供理論依據(jù)。材料與方法:將第4代體外培養(yǎng)的新生及6周齡新西蘭白兔兔鼻軟骨細(xì)胞置于細(xì)胞膜式靜態(tài)牽張應(yīng)力施加裝置上培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測5kPa靜態(tài)牽張應(yīng)力在0～12h內(nèi)對兔鼻軟骨細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果:0～10h內(nèi)5kPa靜態(tài)牽張應(yīng)力組軟骨細(xì)胞增殖指數(shù)隨著靜態(tài)牽張應(yīng)力作用時間的延長不斷上升， 對體外培養(yǎng)兔鼻軟骨細(xì)胞具有較大的促增殖作用，增殖指數(shù)峰值位于10h處;5kPa靜態(tài)牽張應(yīng)力對體外培養(yǎng)的新生兔兔鼻軟骨細(xì)胞具有更大的促增殖作用。結(jié)論:5kPa靜態(tài)牽張應(yīng)力可促進(jìn)體外培養(yǎng)的新生及六周齡新西蘭白兔兔鼻軟骨細(xì)胞增殖活性，提示我們鼻軟骨牽張術(shù)前正畸方法不僅適用于臨床矯治新生兒唇腭裂伴發(fā)鼻畸形，而且有可能用于矯治1歲左右嬰兒甚至更大年齡患兒的唇腭裂伴發(fā)鼻畸形，從而為唇腭裂伴發(fā)鼻畸形的矯治開辟一條新的方法。

[關(guān)鍵詞]靜態(tài)牽張應(yīng)力;兔鼻軟骨細(xì)胞;增殖活性;流式細(xì)胞術(shù)

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)08-1152-04

Clinical Significance of tension force on proliferation of rabbit nasal chondrocytes in vitro

BAI Ming-hai1， WU Han-jiang2，ZHANG Ting-ting3，JIANG Cui-chang1，LING Tian-you2

(1.Department of Orthodontics，Changsha Stomatology Hospital， Changsha 410005，Hunan，China;2.Department of Stomatology，Xiangya Second Hospital，Central South University，Changsha 410011，Hunan，China;3.Department of Laboratory，Xiangya Second Hospital，Central South University，Changsha 410011，Hunan，China)

Abstract:ObjectiveThe purpose of this study was to investigate the effects of tension force on proliferation of rabbit nasalchondrocytes in vitro and its clinical significance.Materials and MethodsThe fourth-passage chondrocytes were harvested from the nose of neonatal and 6-week-old rabbits. A continuous static tension force was applied on the cells in vitro using a cellular static tension force device， and the proliferation of nasal chondrocytes were examined using a flow cytometry. The experimental group were divided into seven groups under continuous 5 kPa static distraction for 0 to 12 hours. ResultsThe results showed that the proliferation of nasal chondrocytes was promoted as the application time of 5kPa static tension force was prolonged (0～10 hours).The maximal proliferationappeared， when the nasal chondrocytes were cultured under 5kPa continuous static tension force for 10 hours (P<0.05). The proliferation of cells in the 5kPa group was obvious (P<0.05). The proliferation of cells in the neonatal rabbit group was more obvious than in the 6-week-old rabbit group (P<0.05).ConclusionsThe date prove that static tension force stimulates in chondrocytes can influence and regulate the growth of nasal chondrocytes. It might provide a new methord for the the therapy of nasal deformity of cleft lip for the neonatal or even older children with the application of nasal cartilage distraction.

Key words:tension force;rabbit nasal chondrocytes;proliferation;flow cytometry

在唇腭裂患者序列治療過程中，對唇腭裂伴發(fā)鼻畸形的處理一直是個難點(diǎn)。有學(xué)者提出[2-4]，患兒出生后立即牽張鼻軟骨術(shù)前正畸，延長短小鼻小柱，可復(fù)位移位的鼻翼軟骨，糾正鼻尖塌陷，大大降低手術(shù)矯治唇腭裂伴發(fā)鼻畸形的難度，使唇裂修復(fù)與鼻畸形矯治能同期完成，獲良好遠(yuǎn)期整復(fù)效果。但鼻軟骨牽張術(shù)前正畸矯治唇腭裂伴發(fā)鼻畸形中軟骨細(xì)胞牽張力的生物力學(xué)機(jī)制如何，國內(nèi)外尚未見相關(guān)基礎(chǔ)理論研究;國外學(xué)者已采用鼻軟骨牽張方法矯治新生患兒鼻畸形，但這種鼻軟骨牽張方法能否用于矯治更大年齡唇腭裂患兒鼻畸形，都是值得探討的問題。

本研究旨在通過觀察體外培養(yǎng)兔鼻軟骨細(xì)胞在靜態(tài)牽張應(yīng)力作用下增殖活性的變化，探討靜態(tài)牽張應(yīng)力促進(jìn)鼻軟骨生長的可行性，為臨床應(yīng)用鼻軟骨牽張術(shù)前正畸矯治唇腭裂伴發(fā)鼻畸形提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)而探索一條矯治唇腭裂伴發(fā)鼻畸形新途徑。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器:SFEG AIR TECH超凈工作臺(蘇州，蘇凈集團(tuán))，F(xiàn)orma Scientific CO2培養(yǎng)箱(美國)，OLYMPUS IX 50 相差顯微鏡(Olympus公司，日本)，MSE MISTRAL 1000水平式低溫離心機(jī)(哈爾濱東聯(lián)電子公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料:Ⅱ型膠原蛋白酶(上海生工公司)，胰蛋白酶(Sigma公司，美國)，DME M培養(yǎng)基(Sigma公司，美國)， 胎牛血清(杭州四季青生物公司)，聚苯乙烯一次性培養(yǎng)瓶，皿，板(Falcon公司，美國)，新生及六周齡純種新西蘭白兔(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動物室提供)，醫(yī)用硅膠膜(化工部有機(jī)硅中心，成都)，醫(yī)用耐酸不銹鋼及常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)器械等。

1.3 細(xì)胞膜牽張力施加裝置(四川大學(xué)生物力學(xué)研究所提供):細(xì)胞膜式牽張力施加裝置如圖1所示。將體外培養(yǎng)的細(xì)胞種植于硅膠膜上，通過硅膠膜密閉隔開細(xì)胞培養(yǎng)小室與液壓小室，利用液體靜張力使膜發(fā)生彈性形變，貼附于膜上的細(xì)胞受到相應(yīng)牽張力。通過調(diào)節(jié)液體的液面差，可以較準(zhǔn)確控制實(shí)驗(yàn)所需的牽張力。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1新西蘭白兔兔鼻軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:兔鼻軟骨原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)到第4代，每天常規(guī)在倒置相差顯微鏡下觀察兔鼻軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)瓶及硅膠膜上的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。采用甲苯胺藍(lán)染色和免疫組化檢測Ⅱ型膠原表達(dá)方法鑒定兔鼻軟骨細(xì)胞。

1.4.2培養(yǎng)小室及硅膠膜處理:本實(shí)驗(yàn)所用硅膠膜厚約0.2mm，直徑38mm，將硅膠膜放入75%酒精浸泡24h，去除可能的其他化學(xué)成分，三蒸水反復(fù)漂洗后浸泡12h，組裝不銹鋼整體培養(yǎng)小室，整體高溫，高壓(121℃，0.1 MPa，25min)滅菌。

1.4.3細(xì)胞力學(xué)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:將第3代培養(yǎng)的兔鼻軟骨細(xì)胞傳代，0.25%胰酶消化后，按2×105個/孔的密度接種于培養(yǎng)膜上，培養(yǎng)膜上預(yù)先加入5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液2ml，于 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃，含95%空氣，5% CO2)培養(yǎng)，培養(yǎng)15h后，用PBS液洗3次，加入15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，依據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.4實(shí)驗(yàn)方案:分別測定第4代體外培養(yǎng)新生及六周齡新西蘭白兔鼻軟骨細(xì)胞(70份樣本)在5kPa牽張力作用下培養(yǎng)(15%胎牛血清濃度)0，2，4，6，8，10，12h后DNA含量(以0h為對照)(流式細(xì)胞儀)。樣本量均為5個。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測:在培養(yǎng)膜加入適量0.25%胰酶，室溫下消化15s 左右，4℃ PBS漂洗，離心(4 000r/min，4min 各一次)，收集鼻軟骨細(xì)胞;5ml 80%酒精固定保存于塑料離心管，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖活性(北京鼎國生物公司)。細(xì)胞增殖活性以增殖指數(shù)(proliferative index，PI)表示，先檢測各細(xì)胞周期表，然后按以下公式計算:

1.6統(tǒng)計分析:所有數(shù)據(jù)輸入SPSS 13.0軟件包進(jìn)行組間方差分析。

2結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)兔鼻軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定:硅膠膜表面生長的軟骨細(xì)胞形態(tài)正常，具有典型多角樣細(xì)胞形態(tài)特征，并可見正在分裂增殖的細(xì)胞;靜態(tài)牽張應(yīng)力刺激培養(yǎng)下硅膠膜上兔鼻軟骨細(xì)胞呈多角形的伸展?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞整體形態(tài)被拉伸。所培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色和免疫組化檢測Ⅱ型膠原表達(dá)結(jié)果為陽性，鑒定為軟骨細(xì)胞(圖2)。

2.2 新生及六周齡新西蘭白兔兔鼻軟骨細(xì)胞在靜態(tài)牽張應(yīng)力作用下增殖活性變化:從表1可見，0～10h內(nèi)5kPa靜態(tài)牽張應(yīng)力組軟骨細(xì)胞增殖指數(shù)隨著牽張力作用時間的延長不斷上升，增殖指數(shù)峰值位于10h處，12h處PI指數(shù)下降;靜態(tài)牽張應(yīng)力對體外培養(yǎng)的新生及6周齡兔兔鼻軟骨細(xì)胞均有促增殖作用，但對體外培養(yǎng)的新生兔兔鼻軟骨細(xì)胞具有更大的促增殖作用。

3討論

3.1 選擇靜態(tài)牽張應(yīng)力值的依據(jù):郭欣[5]等報道，膜式細(xì)胞牽張力施加裝置符合體外細(xì)胞應(yīng)力加載的要求，操作方便，性能可靠，可長時間穩(wěn)定運(yùn)行，已在多種細(xì)胞體外加力實(shí)驗(yàn)中得到應(yīng)用。本課題的預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察到在5kPa荷載下硅膠膜變形率分別為8%，且在這種張應(yīng)力條件下兔鼻軟骨細(xì)胞始終貼壁生長，體外培養(yǎng)鼻軟骨細(xì)胞增殖活性均有改變，因此根據(jù)膜式細(xì)胞牽張力施加裝置特性及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步選用5kPa大小的牽張力。

3.2 體外培養(yǎng)兔鼻軟骨細(xì)胞在5kPa靜態(tài)牽張應(yīng)力作用下的增殖活性變化及其臨床意義:有學(xué)者從細(xì)胞分子水平對軟骨細(xì)胞做了相關(guān)研究，結(jié)果表明:不同大小牽張力作用下均可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的增殖活性變化[6-8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牽張力實(shí)驗(yàn)組與對照組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)， 5kPa即牽張力對兔鼻軟骨細(xì)胞增殖活性的調(diào)控影響明顯，兔鼻軟骨細(xì)胞增殖活性變化與牽張力作用時間有關(guān)。5kPa牽張應(yīng)力實(shí)驗(yàn)組中兔鼻軟骨細(xì)胞的增殖高峰在10h處，12h處增殖活性明顯降低，即不同的作用時間對兔鼻軟骨細(xì)胞周期具有不同的調(diào)節(jié)效應(yīng)，持續(xù)牽張應(yīng)力在一定時間范圍內(nèi)可以促進(jìn)兔鼻軟骨細(xì)胞的增殖活性。這提示適當(dāng)?shù)臓繌埩Υ碳び欣诟纳萍?xì)胞功能和活性，但長期較大的牽張力刺激可能引起細(xì)胞損傷，反而阻礙軟骨細(xì)胞分化增殖，抑制細(xì)胞的活力。因此我們在臨床應(yīng)用鼻軟骨牽張術(shù)前正畸矯治鼻畸形時應(yīng)選用適當(dāng)?shù)臓繌埩ψ饔脮r間，時間過長的牽張力反而有可能不利于兔鼻軟骨的延長和軟骨量的增加。有關(guān)適宜強(qiáng)度的牽張力周期及長期作用對軟骨細(xì)胞的影響效果有待進(jìn)一步研究。

3.3 體外培養(yǎng)不同年齡的兔鼻軟骨細(xì)胞在5kPa靜態(tài)牽張應(yīng)力作用下的增殖活性變化及其臨床意義:1984年，Matsuo[1]等報道，耳廓軟骨畸形患兒在出生后立即行軟骨牽張矯治，可使耳軟骨的面積和體積增加，獲得了良好遠(yuǎn)期效果。Matsuo認(rèn)為，在圍產(chǎn)期階段，母親體內(nèi)雌激素含量上升，相應(yīng)導(dǎo)致胎兒細(xì)胞內(nèi)透明質(zhì)酸含量增加，透明質(zhì)酸通過破壞細(xì)胞間質(zhì)成份降低軟骨，韌帶和相關(guān)組織的彈性程度，使其柔軟而容易塑形。而出生6周后嬰兒體內(nèi)雌激素水平開始下降，軟骨變得富有彈性而不易塑形。因此認(rèn)為唇腭裂伴發(fā)鼻畸形的牽張矯治應(yīng)在出生后立即進(jìn)行。20世紀(jì)90年代，在Matsuo研究基礎(chǔ)上，Cuting，Grayson，Maull[2-4]等報道唇裂鼻一期修復(fù)術(shù)前應(yīng)用牙槽突復(fù)位鼻畸形矯治器(Nasoalveolar Molding Plate，NAM)牽張鼻軟骨，采用非手術(shù)鼻軟骨牽張方法矯治唇腭裂伴發(fā)鼻畸形取得了良好效果(牽張裝置示意圖見圖3、4)。本研究從體外細(xì)胞培養(yǎng)角度驗(yàn)證了鼻軟骨牽張術(shù)前正畸方法矯治唇腭裂伴發(fā)鼻畸形的可行性。本研究結(jié)果表明:5kPa牽張力對不同年齡兔鼻軟骨細(xì)胞的增殖活性變化的影響不同，牽張力對新生兔體外培養(yǎng)兔鼻軟骨細(xì)胞的促增殖作用更為顯著。我們推測可能是由于新生兔兔鼻軟骨細(xì)胞較6周齡兔兔鼻軟骨細(xì)胞在牽張力刺激下產(chǎn)生的具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的細(xì)胞因子的能力更強(qiáng)，所以對牽張力等刺激因素更為敏感有關(guān)，其機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果還表明，牽張力無論是對新生兔還是6周齡兔體外培養(yǎng)兔鼻軟骨細(xì)胞均有促增殖作用。本實(shí)驗(yàn)是運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分析單一因素對細(xì)胞增殖活性影響，不受體內(nèi)雌激素含量高低影響，無法用Matsuo等學(xué)說解釋;資料表明:六周齡新西蘭白兔年齡相當(dāng)于人類1歲左右兒童年齡[9]，故牽張力對新生及6周齡新西蘭白兔兔鼻軟骨細(xì)胞增殖活性均有影響這一結(jié)果提示我們:在臨床上鼻軟骨牽張方法除適用于矯治新生唇腭裂患兒的鼻畸形外，也可能用于矯治1歲左右甚至更大年齡患兒的鼻畸形，這就為臨床上采用鼻軟骨牽張技術(shù)矯治唇腭裂伴發(fā)鼻畸形提出了一條新的思路，擴(kuò)大了適應(yīng)證范圍，可能具有潛在臨床應(yīng)用價值。

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[收稿日期]2010-05-28[修回日期]2010-07-12

編輯/張惠娟