黑素細胞的體外培養(yǎng)研究進展及意義

黑素細胞(Melanocyte 簡稱MC)來源于外胚層的神經(jīng)嵴，在胚胎8～10周時逐漸遷移至皮膚，廣泛存在于機體各組織，可見于表皮、毛囊、真皮、眼、血管周圍、外周神經(jīng)及交感神經(jīng)干、軟腦膜、內(nèi)耳、膽囊、卵巢等結(jié)構(gòu)。通過黑素細胞(MC)的體外純培養(yǎng)可以研究黃褐斑、白癜風、白發(fā)等色素障礙性疾病的發(fā)病機制，也可以利用黑素細胞模型來篩選治療這些疾病的藥物和方法。同時對于研究皮膚色素代謝、皮膚老化、良惡性黑素腫瘤也具有重要意義[1]。近十年來，黑素細胞的體外培養(yǎng)方法逐漸成熟，從需要人工配制和添加各種培養(yǎng)成分到商品化培養(yǎng)基的出現(xiàn)，從需要添加致癌和毒性培養(yǎng)成分到新的無毒性、無致畸變培養(yǎng)基的出現(xiàn)，從培養(yǎng)表皮來源的黑素細胞到培養(yǎng)毛囊、葡萄膜等各種來源的黑素細胞甚至黑素細胞的干細胞，從單一黑素細胞的培養(yǎng)到含黑素細胞等多種細胞混合的組織工程皮膚培養(yǎng)，培養(yǎng)條件的成熟為我們利用這些模型進行相關(guān)研究創(chuàng)造了便利?，F(xiàn)將黑素細胞的體外培養(yǎng)研究進展及研究意義綜述如下:

1黑素細胞的培養(yǎng)來源

黑素細胞(Melanocyte，MC)來源于外胚層的神經(jīng)嵴，在胚胎8～10周時逐漸遷移至皮膚。黑素細胞廣泛存在于機體組織，最常見于表皮、毛囊、真皮、眼、血管周圍、外周神經(jīng)及交感神經(jīng)干、軟腦膜、內(nèi)耳、膽囊、卵巢等，分為樹突型和非樹突型黑素細胞，主要分布在表皮基底層，約占基底層細胞的10%，可將黑素顆粒轉(zhuǎn)移至角質(zhì)形成細胞。表皮MC基底以半橋粒與基底膜相連，但不與周圍角質(zhì)形成細胞形成橋粒。MC在頂部發(fā)出數(shù)個突起，每個突起與10～36個角質(zhì)形成細胞接觸，形成表皮黑素單元。黑素細胞的主要功能是在黑素小體合成黑素顆粒，黑素顆粒進入角質(zhì)形成細胞后像傘樣或者帽樣覆蓋于細胞核頂上方，保護細胞核免受紫外線輻射損傷[2]。而非樹突型黑素細胞主要分布于色素膜、視網(wǎng)膜、腦膜，不能轉(zhuǎn)移黑素顆粒。黑素細胞形狀各異，大小不一，可呈圓形、橢圓形、梭形等，胞質(zhì)透明，胞核較小。人的表皮約有20億個黑素細胞，重約1g，平均每平方毫米1 560個對稱分布于全身。雖然人種之間黑素細胞數(shù)量較恒定，無明顯差異。但每個體各部位間黑素細胞的數(shù)量卻不盡相同。在軀干部密度最小，約為900個/平方毫米，陰莖包皮最多，約有2 400個/平方毫米，頭皮約有2 000個/平方毫米，其他部位約為1 000個/平方毫米[2]。此外，在暴露部位、身體褶皺處及乳暈、腋窩、生殖器及會陰部，黑素細胞的分布密度亦較高。因此，目前黑素細胞培養(yǎng)常用的供區(qū)為包皮，也有學者成功進行了毛囊黑素和脈絡膜黑素細胞的培養(yǎng)[3-4]。

2黑素細胞的培養(yǎng)條件

MC在普通培養(yǎng)基中很難生長，這是因為正常皮膚中MC數(shù)量很少，約占表皮細胞的2%～4%，占基底層細胞的8%～10%，同時，其增殖能力較角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞弱，體外培養(yǎng)的早期常因角質(zhì)形成細胞或成纖維細胞的過度生長而失敗。黑素細胞培養(yǎng)條件進展如下:

2.1 建立含有十四烷酞佛波醇乙酯(TPA)+霍亂毒素(CT)的黑素細胞培養(yǎng)方法:1982年，Eisinger[5]首次體外培養(yǎng)皮膚MC成功。他們利用胰蛋白酶消化全厚皮標本分離出表皮，用胰蛋白酶消化成單細胞懸液。但是需要在培養(yǎng)基中添加l0ng/ml的TPA和l0nM的CT，并認為體外培養(yǎng)成功的關(guān)鍵是TPA對KC的毒性作用和CT對Fb的抑制作用。他們還發(fā)現(xiàn)TPA的作用具有濃度依賴性，TPA在濃度為1～10ng/ml時可抑制KC的貼壁與生長，但卻刺激MC的貼壁和增殖，而0.1ng/ml和100ng/ml的TPA不具有這種作用。10ng/ml的TPA和10nM的CT， pH7.2和5%的小牛血清是MC的最佳培養(yǎng)條件。至今這一方法仍被很多學者采用。

2.2 不含TPA但需要CT的培養(yǎng)方法:由于TPA是公認的強致癌劑，在體內(nèi)不易被代謝，可長期對細胞產(chǎn)生多種生物學效應，因此，有人擔心利用TPA培養(yǎng)出的黑素細胞用于臨床移植時可能存在一定的致癌風險。1988年，Halaban等[6]首先發(fā)現(xiàn)bFGF可刺激MC的生長。他們將處于對數(shù)生長期的KC和Fb的提取液與MC共同培養(yǎng)，用[3H]胸苷摻入法檢測MC的DNA合成狀況，發(fā)現(xiàn)提取液可顯著增加MC的DNA合成，提示bFGF是MC的天然分裂原。國內(nèi)學者丁國斌[7]利用堿性成纖維細胞生長因子/霍亂毒素建立了人正常黑素細胞體外純培養(yǎng)系統(tǒng)。也有學者利用5-Fu[8]、下丘腦提取液(bovine hypothalamus extract BHE)或者內(nèi)皮素(ET)代替TPA來進行黑素細胞的培養(yǎng)[9]，其共同特點是這些物質(zhì)具有細胞的有絲分裂原活性。以上這些培養(yǎng)方法大都采用DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基或者MCDB153作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.3 不含CT但需要TPA的培養(yǎng)方法:由于擔心CT的毒性作用，人們也嘗試摒棄CT來培養(yǎng)黑素細胞。各試劑公司也生產(chǎn)了成品培養(yǎng)基，省去了繁瑣的配制過程。目前有M254培養(yǎng)基(Cascade公司產(chǎn)品)成功進行了黑素細胞的培養(yǎng)[10]。它包含一些必需和非必需氨基酸、維生素、其他有機物質(zhì)、微量元素和無機鹽。不包含抗生素、抗真菌藥物、激素、生長因子或其他蛋白質(zhì)，這種培養(yǎng)基含HEPES和碳酸氫鹽緩沖液。為了進行黑素細胞的長期傳代培養(yǎng)，必須在這種培養(yǎng)基中加入一種黑素細胞生長添加液(HMGS)。此添加劑含牛垂體提取物(BPE)、胎牛血清、牛胰島素、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、氫化可的松、肝素和佛波醇乙酸酯(PMA或者TPA)。另外還有一種不含有PMA或者TPA的添加劑2，但它含有內(nèi)皮素成分，適合用于新生兒黑素細胞或者干細胞的培養(yǎng)。

2.4 不含有TPA和CT的培養(yǎng)方法:科研工作者以DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入了一定濃度的堿性成纖維細胞生長因子bFGF及其他成分，成功培養(yǎng)了黑素細胞[11-12]。市售的以此成分為主的黑素細胞專用培養(yǎng)基有ScienCell和Promocell公司的Melanocyte Medium-2 (MelM-2)， 它不含有TPA，但含有一些必需和非必需氨基酸、維生素、其他有機物質(zhì)、微量元素和無機鹽、激素和生長因子等，使用時需添加黑素細胞生長添加劑MelGS-2(不含TPA)和少量的胎牛血清。

2.5 各種生長因子的添加:黑素細胞培養(yǎng)需要加入一些特殊的生長因子。CT是神經(jīng)毒素，可激活腺苷酸環(huán)化酶，增加細胞內(nèi)cAMP的濃度。IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)是磷酸二酯酶強有力的抑制劑，可提高dbcAMP 的水平，在原代培養(yǎng)中誘導黑素細胞分化。霍亂毒素和IBMX在TPA的協(xié)同作用下，可大大增加細胞內(nèi)cAMP的水平。TPA可選擇性促進黑素細胞增殖，它單獨應用不能最有效地促進黑素細胞增殖， 若分別加入霍亂毒素和 IBMX，或同時加入霍亂毒素和IBMX，均可大大提高TPA的促分裂作用;TPA不能單獨提高細胞內(nèi)cAMP的水平[13]。

有學者將所有因子大致分為四類:包括作用較強的絲裂原活性物質(zhì)，如FGFs、HGF/SF、 M/SCF、內(nèi)皮素-1、TPA、CT、IBMX等，作用較弱的絲裂原活性物質(zhì)如促黑素激素(MSH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、黑素瘤生長刺激因子(MGSA)、胃泌素釋放肽(GRP)，部分因子已被證實對其生長無作用，包括表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、血小板源生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、IL-1 和IL2、垂體激素，其他如hPRL、hCG、 hFSH、內(nèi)啡肽、促甲狀腺腺釋放激素、胸腺肽、凝血酶、血管活性腸肽(VIP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、組胺、魚精蛋白、多巴胺、 腺苷、大分子內(nèi)皮素、 P物質(zhì)、降鈣素、維甲酸、腦啡肽、腎上腺素、乙酰膽堿、刀豆素前列腺素A、 E、F等，起抑制作用的有TGF-β、interferon-β[14]。其他常用于MC培養(yǎng)的添加劑如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、皮質(zhì)醇、三碘甲狀腺原胺酸、氫化考的松、乙醇胺、磷酸乙醇胺等，但對于它們的精確作用還所知不多，鈣濃度對培養(yǎng)早期的MC基本上無影響。

2.6其他培養(yǎng)條件:Horikoslu等[15]研究了氧氣對MC生長的影響，發(fā)現(xiàn)氧分壓為6～34mmHg時MC生長良好，隨著氧分壓的升高，MC的生長受到抑制，而TYR活性逐漸降低。Eisinger等[16]發(fā)現(xiàn)pH6.0時Fb生長良好，而pH7.2最適宜MC的生長。己知血清對多種細胞的生長均有促進作用，Eisinger等[16]認為5% FCS對MC的生長最為適宜，無FCS或0.5%FCS組MC生長緩慢，只有低濃度FCS組MC可長期純化生長。

3黑素細胞培養(yǎng)的意義

3.1 在皮膚美容疾病和色素腫瘤研究中的意義:目前黑素細胞體外培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛應用于各種色素性疾病的基礎(chǔ)及臨床研究，如外傷后色素沉著或者色素脫失、各種獲得性色素障礙性疾病如黃褐斑、老年斑、白癜風及良惡性黑素瘤的病因?qū)W、病理學研究，對于祛除色素藥物的機理、療效及毒性的研究等。目前已有學者將培養(yǎng)的色素細胞進行移植治療白癜風，黑素干細胞的研究也取得了重要進展[17-18]。

3.2 黑素細胞在神經(jīng)內(nèi)分泌領(lǐng)域的意義:十多年前，人們已預測黑素細胞具有感受和調(diào)節(jié)能力，發(fā)出的指令轉(zhuǎn)化為外部或內(nèi)部信號參與機體調(diào)控網(wǎng)絡保持皮膚穩(wěn)態(tài)。有證據(jù)表明紫外線輻射、生物因子或機械因素刺激黑素細胞產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)和激素，表達相應受體，例如兒茶酚胺，5羥色胺，褪黑激素，促腎上腺皮質(zhì)激素，β-內(nèi)啡肽或黑素細胞刺激素，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子，以及相關(guān)的皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮和類固醇激素的前體。它們的產(chǎn)生遵循受下丘腦-垂體-腎上腺軸和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控。合成或分泌的黑素中間體包括L-多巴或它的衍生物可以進入全身循環(huán)而影響整個機體[19]。神經(jīng)肽和α-黑素細胞刺激激素(α-MSH)在黑素瘤[20]、肥胖、高血壓[21]、創(chuàng)傷[22]等疾病中的作用和β-MSH在色素沉著中的作用研究也越來越多[23]，進一步證實黑素細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌的關(guān)系。

總之，黑素細胞培養(yǎng)是研究皮膚相關(guān)疾病的重要手段。進行細胞培養(yǎng)時要按照色素細胞的分布特點選擇合適年齡供體標本，不同培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基中的添加劑可以影響MC的生物學行為，進行實驗設計和結(jié)果分析時必須考慮這些因素。

[參考文獻]

[1]劉 熔，李紅健.黑色素細胞體外培養(yǎng)技術(shù)的研究及應用[J].新疆醫(yī)學，2008，38(9):169-171.

[2]張學軍.現(xiàn)代皮膚病學基礎(chǔ)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:100-120.

[3]張汝芝，朱文元，王大光，等.毛囊無黑素性黑素細胞的分離和培養(yǎng)[J].臨床皮膚科雜志，2003，32(9):509-511.

[4]王 玲，盧清君，王寧利，等.人眼脈絡膜黑色素細胞的培養(yǎng)與鑒定[J].眼科研究，2006，24(3):248-251.

[5]Eisinger M，Marko O.Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin[J].Proc Natl Acad Sci USA，1982，79:2018-2022.

[6]Halaban R，Langdon R，Birchall N，et al.Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural imtogen of melanocytes[J].J Cell Biol，1988，107:1611-1619.

[7]丁國斌，陳 璧，湯朝武.利用堿性成纖維細胞生長因子/霍亂毒素建立人正常黑素細胞體外選擇性純培養(yǎng)[J].中華創(chuàng)傷雜志，2001，17(7):438-439.

[8]Tsuji T，Karasek M.A procedure for the isolation of primary cultures of melanocytes from newborn and adult human skin[J].J Invest Dermatol，1983，81:179-180.

[9]Imokawa G，Yada Y，Kimura M.Signalling mechanisms of endothelin-inducedmitogenesis and melanogenesis in human melanocytes[J].Biochem J，1996，314:305-312.

[10]張汝芝，朱文元，馬 佳.人表皮黑素細胞培養(yǎng)條件的探討[J].蚌埠醫(yī)學院學報，2006，31(2):126-128.

[11]羅 衛(wèi)，趙 廣，向培德，等.正常人黑素細胞的體外培養(yǎng)與觀察[J].華南國防醫(yī)學雜志，2007，21(5):4-5.

[12]Rafal Czajkowski，Waldemar Placek，Tomasz Drewa，et al.Autologous Cultured Melanocytes in Vitiligo Treatment[J].Dermatol Surg，2007，33:1027-1036.

[13]項蕾紅，鄭志忠，祝綠川.黑素細胞體外純培養(yǎng)及生物學特性鑒定[J].臨床皮膚科雜志，2001，30(3):166-167.

[14]Halaban Ruch.The Regulation of Normal Melanocyte Proliferation[J].Pigment Cell Res，2000，13:4-14.

[15]Horikoshi T，Balin AK，Carter DM.Effects of oxygen tension on the growth and pigmentation of normal human melanocytes[J].J Invest Dermatol，1991，96:841-844.

[16]Eisinger M，Marko O.Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin[J].Proc Natl Acad Sci USA，1982，79:2018-2022.

[17]Lang D，Lu MM，Huang L，et al. Pax3 functions at a nodal point in melanocyte stem cell differentiation[J]. Nature，2005，433(7028):884-887.

[18]Nishimura EK，Granter SR，F(xiàn)isher DE，et al.Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche[J].Science，2005，307(5710):720-724.

[19]Slominski A.Neuroendocrine activity of the melanocyte[J].Exp Dermatol，2009，18(9):760-763.

[20]Cardones AR，Grichnik JM.Alpha-Melanocyte stimulating hormone induced eruptive nevi[J].Arch Dermatol，2009，145(4):441-444.

[21]Baltatzi M，Hatzitolios A，Tziomalos K，et al.Neuropeptide Y and alpha-melanocyte-stimulating hormone: interaction in obesity and possible role in the development of hypertension[J].Int J Clin Pract，2008，62(9): 1432-1440.

[22]Todd SR，Kao LS，Catania A，et al.Alpha-melanocyte stimulating hormone in critically injured trauma patients[J].J Trauma，2009，66(2):465-469.

[23]Spencer JD，Schallreuter KU.Regulation of pigmentation in human epidermal melanocytes by functional high-affinity beta-melanocyte stimulating hormone/melanocortin-4 receptor signaling[J].Endocrinology， 2009，150(3):1250-1258.

[收稿日期]2010-05-07 [修回日期]2010-07-12

編輯/李陽利