SDF-1對創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞定向趨化及促創(chuàng)面愈合效應(yīng)的研究

[摘要]目的:觀察干細(xì)胞趨化因子SDF-1在創(chuàng)面愈合過程中調(diào)控表皮干細(xì)胞定向遷移促進(jìn)創(chuàng)面愈合的過程。方法:制作大鼠背部全層皮膚缺損模型，隨機(jī)分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組:①SDF-1組;②AMD3100(CXCR4受體的拮抗劑)組;③空白對照組。分別于致傷后1天、3天、5天、7天和12天照相計(jì)算傷后不同時(shí)間創(chuàng)面占初始創(chuàng)面的百分比并取材。運(yùn)用HE染色和免疫組化技術(shù)觀察創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞定向遷移分化的特點(diǎn)，尋找其規(guī)律。結(jié)果:與其他兩個(gè)處理組相比，SDF-1處理組愈合時(shí)間縮短，其創(chuàng)緣皮表皮基底層細(xì)胞分裂增殖旺盛，創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞數(shù)目明顯多于其他兩組。結(jié)論:在創(chuàng)面愈合過程中，SDF-1可以調(diào)控表皮干細(xì)胞向創(chuàng)緣遷移，加速創(chuàng)面上皮化。

[關(guān)鍵詞]基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1;表皮干細(xì)胞;創(chuàng)面愈合

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)08-1156-05

SDF-1 accelerates wound healing via recruitment of epidermal stem cells

ZHANG Yi1，GONG Xi-yuan1，SUN Xue-wu1，QIU Xiao-dong1，GUO Dan-feng1，ZHANG Guan-jun1，HAN Ji-qin1，

CAO Chuan2

(1.Department of Plastic Surgery，Jinan Central Hospital of Shandong University，Jinan 200013，China; 2.Department of Plastic Surgery，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the stem cell chemokine SDF-1 in the regulation of wound healing migration of epidermal stem cells to promote wound healing process.MethodsRat dorsal full-thickness skin defects were randomly divided into three experimental groups: ①SDF-1 group; ②AMD3100 (CXCR4 receptor antagonist) group;③control group. 1 day，3 days，5 days，7 days and 12 days after injury camera calculates the wound at different times，and total percentage of the initial wound drawn. Using HE staining and immunohistochemical observation of a margin of epidermal migration and differentiation of stem cell characteristics，to find its own rules. ResultsCompared with the other two treatment groups，SDF-1 treatment to shorten healing time，the margin of skin epidermal basal cell division and proliferative margin of the number of epidermal stem cells was more than the other two groups.ConclusionIn the wound healing process，SDF-1 can regulate epidermal stem cells migrate to the wound edge，accelerate wound epithelization.

Key words:SDF-1; epidermal stem cells; wound healing

位于表皮基底層的表皮干細(xì)胞是皮膚組織發(fā)生、創(chuàng)面修復(fù)與改建的關(guān)鍵細(xì)胞[1-2]。β1整合素和角蛋白19(Keratin-19 K19)染色呈陽性為其鑒別手段[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面修復(fù)過程中表皮干細(xì)胞可向創(chuàng)緣定向遷移[5]。理論上講，這種遷移趨勢是由趨化因子與其靶細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合，從而調(diào)控這些細(xì)胞的遷移、增殖和分化來發(fā)揮促修復(fù)作用。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cellderived factor-1 SDF-1)和其受體CXCR4廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞，對一些組織器官發(fā)育和損傷后修復(fù)再生起重要調(diào)節(jié)作用。我們前期工作發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞免疫熒光染色顯示表皮干細(xì)胞表面CXCR4受體表達(dá)呈陽性，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測表皮干細(xì)胞表面CXCR4抗原陽性率為43%，且創(chuàng)面在愈合過程中的創(chuàng)緣組織勻漿內(nèi)的SDF-1表達(dá)量明顯增多[6]，由此我們猜測在創(chuàng)面愈合過程中，SDF-1/CXCR4軸有可能參與調(diào)控創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞向創(chuàng)面內(nèi)遷移從而促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)過程。

1材料和方法

1.1 主要設(shè)備及試劑:石蠟切片機(jī)，德國LEICA公司生產(chǎn);實(shí)驗(yàn)攝像顯微鏡，日本Olympus生產(chǎn)。

AMD3100由美國Sigma公司提供;SDF-1因子由美國peprotech公司提供;K19抗體(Keratin19 Ab-1)由NeoMarker公司提供(小鼠來源);β1整合素抗體(β1 Integrin Ab-1)由Chemicon International公司提供(小鼠來源);過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase)試劑盒和DAB染色試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供;戊巴比妥鈉由上海行知化工工廠提供。

1.2 動物模型的制備:出生50天的健康清潔級SD大鼠90只，雌雄不限，由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院動物所提供。隨機(jī)分為3組:SDF-1組、AMD3100組、空白對照組。1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射后，鼠背部脫毛，用直徑為6mm的打孔器制作2個(gè)全層皮膚缺損的圓形創(chuàng)面。三個(gè)治療組于致傷后即刻、1天、2天、3天、4天分別在創(chuàng)緣注射SDF-1因子1μg，AMD3100 125μg，生理鹽水0.1ml，1次/天，隨后觀察創(chuàng)面愈合情況。

1.3 致傷后處理及取材:所有實(shí)驗(yàn)動物均行肉眼觀察，并記錄創(chuàng)面愈合情況(創(chuàng)面愈合以創(chuàng)面完全封閉且完全上皮化為判定標(biāo)準(zhǔn))。三組在致傷后1天、3天、5天、7天和12天隨機(jī)處死5只大鼠，取背部2個(gè)創(chuàng)面的創(chuàng)緣組織(附帶部分正常皮膚組織)，置于10%甲醛液內(nèi)固定。常規(guī)石蠟包埋，系列切片，進(jìn)行HE染色、β1整合素和K19染色。免疫組化檢測采用鏈親和素-過氧化物(Streptavidin/Peroxidase，SP)法。小鼠抗大鼠β1整合素多克隆抗體(工作濃度1:1000)，小鼠抗大鼠K19單克隆抗體(工作濃度1:1000)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按試劑盒說明說進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。另外以PBS代替β1整合素多克隆抗體、K19單克隆抗體作為空白對照。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 創(chuàng)面面積計(jì)算:用數(shù)碼相機(jī)拍攝鼠背部創(chuàng)面及創(chuàng)面旁的標(biāo)尺，以標(biāo)尺校準(zhǔn)創(chuàng)面面積大小，應(yīng)用Image J軟件分析測量創(chuàng)面面積。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞的判定:結(jié)果以細(xì)胞膜(β1整合素)、細(xì)胞漿(K19)呈棕黃色著色為強(qiáng)陽性，黃色著色為陽性，淡黃色為弱陽性。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析，結(jié)果以x±s表示。以P﹤0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P<0.01視為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著，P﹥0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著。

2結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果:三組大鼠在致傷3天后，濕潤的創(chuàng)面逐漸變干燥，無異味、滲出，SDF-1組創(chuàng)面稍有皺縮，其它兩組變化則不明顯。致傷后5天，SDF-1組大鼠創(chuàng)緣開始出現(xiàn)肉眼可見的新生粉紅色上皮組織，空白對照組和AMD3100組大鼠創(chuàng)面則變化不明顯;致傷后7天，空白對照組大鼠創(chuàng)面開始縮小，創(chuàng)緣出現(xiàn)肉眼可見的新生上皮組織。7天后SDF-1組的創(chuàng)面面積為初始面積的51.8%，11天后創(chuàng)面基本愈合。而空白對照組在致傷后7天的創(chuàng)面面積為初始面積的56.1%，13天后創(chuàng)面愈合。AMD3100組在致傷后7天的創(chuàng)面面積為初始面積的59.9%，15天后創(chuàng)面基本愈合(結(jié)果見表1)。

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 HE染色:傷后1天，SDF-1組創(chuàng)緣表皮基底層細(xì)胞排列疏松，胞漿淡染，細(xì)胞核仁明顯，細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯分裂增殖狀態(tài)(圖1);空白對照組創(chuàng)緣表皮基底層細(xì)胞排列較為規(guī)整，可見少量胞漿淡染，核仁形成的細(xì)胞(圖2);而AMD3100組創(chuàng)緣基底層細(xì)胞排列較為疏松，無明顯的核仁形成(圖3)。傷后3天，SDF-1組創(chuàng)緣表皮層明顯增厚，表皮層細(xì)胞呈現(xiàn)向創(chuàng)面內(nèi)遷移的趨勢，遷移細(xì)胞大都胞漿淡染，且核仁明顯，基底層細(xì)胞增大，排列疏松，呈現(xiàn)出旺盛的增殖狀態(tài)(圖4);空白對照組創(chuàng)緣表皮增厚不明顯，但可見向創(chuàng)面遷移的表皮基底細(xì)胞，其形態(tài)比正?；准?xì)胞稍大，胞漿淡染，核仁明顯(圖5);AMD3100組創(chuàng)緣基底排列較為疏松，未見明顯向創(chuàng)面遷移的細(xì)胞(圖6)。傷后7天，SDF-1組新生表皮組織內(nèi)可見除角質(zhì)層外的排列規(guī)則的各層細(xì)胞(圖7);空白對照組創(chuàng)緣可見明顯增厚由基底細(xì)胞和棘細(xì)胞構(gòu)成的新生表皮，細(xì)胞排列疏松(圖8);AMD3100組創(chuàng)緣開始出現(xiàn)少量細(xì)胞淡染、核仁明顯的基底細(xì)胞，并出現(xiàn)向創(chuàng)面內(nèi)遷移的趨勢，但創(chuàng)緣新生表皮層數(shù)明顯少于其他兩組(圖9)。

2.2.2 K19免疫組化染色:傷后1天，三個(gè)處理組創(chuàng)緣表皮細(xì)胞均未見明顯陽性表達(dá)(圖10、11和12);傷后3天，SDF-1組創(chuàng)緣表皮棘細(xì)胞層和基底層細(xì)胞胞漿呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖13);空白對照組創(chuàng)緣表皮基底細(xì)胞有少量細(xì)胞胞漿表達(dá)陽性(圖14);而AMD3100組創(chuàng)緣表皮細(xì)胞無陽性表達(dá)(圖15);傷后7天，SDF-1組創(chuàng)緣表皮增厚，創(chuàng)面內(nèi)可見大量胞漿表達(dá)陽性的表皮細(xì)胞嵌入，基底細(xì)胞體積增大，排列松散，可見核仁形成(圖16);空白對照組創(chuàng)緣陽性細(xì)胞較傷后3天明顯增多，但陽性細(xì)胞數(shù)少于SDF-1組(圖17);AMD3100組創(chuàng)緣表皮可見散在的陽性細(xì)胞，表達(dá)較弱(圖18)。

2.2.3 β1整合素免疫組化染色:傷后1天，SDF-1組創(chuàng)緣表皮基底有少量膜染色陽性的細(xì)胞(圖19);空白對照組和AMD3100組創(chuàng)緣表皮胞膜均無陽性表達(dá)(圖20和圖21);三組表皮細(xì)胞均無向創(chuàng)面遷移的趨勢。傷后3天，SDF-1組創(chuàng)緣表皮大量細(xì)胞胞膜染色陽性，且陽性細(xì)胞散在分布于創(chuàng)面內(nèi)(圖22);空白對照組創(chuàng)緣表皮細(xì)胞胞膜開始出現(xiàn)棕黃色著色，但數(shù)量較少(圖23);AMD3100組創(chuàng)緣表皮細(xì)胞無陽性表達(dá)(圖 24)。傷后7天，SDF-1組創(chuàng)緣表皮層可見更多的膜表達(dá)陽性細(xì)胞分布(圖25);空白對照組創(chuàng)緣表皮層陽性細(xì)胞也逐漸增多，但數(shù)目明顯少于SDF-1組(圖26);AMD3100組創(chuàng)緣表皮層開始出現(xiàn)膜陽性的細(xì)胞分布，但數(shù)量明顯少于其他兩組(圖27)。

3討論

在創(chuàng)面愈合過程中，趨化因子不僅能促進(jìn)原位細(xì)胞遷移、炎癥細(xì)胞浸潤，還可以促進(jìn)皮膚上皮化修復(fù)，組織重塑和血管生成[7]。SDF-1在許多組織內(nèi)呈組成性表達(dá)，SDF-1與其唯一受體CXCR4結(jié)合后，對許多生物學(xué)過程起重要調(diào)節(jié)作用。如在生理?xiàng)l件下是淋巴細(xì)胞的趨化劑[8];在病理?xiàng)l件下，SDF-1可以募集內(nèi)皮前體細(xì)胞向梗死的心肌病灶內(nèi)[9]以及腫瘤微循環(huán)內(nèi)遷移[10]。SDF-1/CXCR4在人類正常皮膚上也有表達(dá)，這可能與維持皮膚內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有關(guān)[11]。

表皮層中的基底細(xì)胞層內(nèi)排列著一些體積小、核大、核/漿比例大、細(xì)胞內(nèi)RNA含量低的典型非成熟細(xì)胞[12]，即維持皮膚正常更新代謝和修復(fù)受損皮膚的表皮干細(xì)胞。創(chuàng)緣組織HE染色發(fā)現(xiàn)，SDF-1處理組創(chuàng)緣新生表皮層明顯增厚，基底層細(xì)胞排列疏松，胞體增大，胞漿淡染，細(xì)胞核仁明顯，細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯分裂增殖狀態(tài)，且這些增殖旺盛的細(xì)胞大量嵌入創(chuàng)面內(nèi)。為了驗(yàn)證嵌入細(xì)胞的性質(zhì)，對創(chuàng)緣組織行K19、β1整合素染色(K19、β1整合素是當(dāng)今學(xué)術(shù)界公認(rèn)的表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物[4，12])，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合過程中創(chuàng)緣基底層陽性細(xì)胞由下至上向創(chuàng)面內(nèi)遷移，且創(chuàng)緣陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，而這種遷移效應(yīng)可以被AMD3100阻斷，由此我們認(rèn)為創(chuàng)面可以通過分泌SDF-1調(diào)控表皮干細(xì)胞遷移，修復(fù)受損創(chuàng)面。

除此之外，SDF-1可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，加速新生血管生成[13];SDF-1還促使造血前體干細(xì)胞從造血微環(huán)境向外周組織內(nèi)遷移，并使這些細(xì)胞在外周組織內(nèi)定居，修復(fù)受損組織[14]，這些從骨髓動員至外周的干細(xì)胞也可能參與創(chuàng)面修復(fù)。Toksoy[15]認(rèn)為在創(chuàng)面愈合過程中內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是分泌SDF-1的主要細(xì)胞。與內(nèi)皮細(xì)胞類似，成纖維細(xì)胞在傷口愈合過程中增殖也受到了SDF-1的調(diào)控。成纖維細(xì)胞的增殖活力與SDF-1的分泌量密切相關(guān)。在傷口愈合的晚期，SDF-1分泌量下降，成纖維細(xì)胞的增殖效應(yīng)終止同時(shí)基質(zhì)合成量減少，由富含成纖維細(xì)胞的肉芽組織衍化為瘢痕組織。成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞的增殖與SDF-1呈正比的量效關(guān)系[16]。

綜上所述，SDF-1促進(jìn)創(chuàng)面愈合是一個(gè)通過動員多種細(xì)胞參與的過程，它不僅可以促進(jìn)新生血管的形成、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，還可以趨化表皮干細(xì)胞的遷移，加速創(chuàng)面上皮化的進(jìn)程，這為研究趨化因子治療難治性創(chuàng)面開辟了新的研究思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Janes SM，Lowell S，Hutter C. Epidermal stem cells[J]. J Pathol，2002，197(4):479-451.

[2]付小兵，孫曉慶，孫同柱，等. 表皮細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)皮膚干細(xì)胞分化加速受創(chuàng)表皮再生的研究[J].中國修復(fù)與重建外科雜志，2002，16(1):31-32.

[3]Bickenback JR，Chism E. Selection and extended growth of murine epidermal stem cell in culture[J]. Exp Cell Res，1998，244(1):184-185.

[4]Slack JMW. Stemcell in epithelial tissues[J]. Science， 2000， 287(5457) :1431-1432.

[5]李建福，付小兵，盛志勇，等. 創(chuàng)面愈合過程中創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞的再分布[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83(3):228-230.

[6]李丹，李世榮，曹川. 創(chuàng)面分泌液對表皮干細(xì)胞體外趨化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2007，36(21):2174-2175.

[7]Gillitzer R，Goebeler M.Chemokines in cutaneous wound healing[J].Leukoc Biol，2001，69(4):513-521.

[8]Zou YR，Kottmann AH， Kuroda M， et al. Function of the chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development[J]. Nature，1998，393(6685):595-599.

[9]Askari AT，Unzek S，Popovic ZB，et al. Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy[J]. Lancet，2003，362(9385):697-703.

[10]Burger JA， Kipps TJ. CXCR4: a key receptor in the crosstalk between tumor cells and their microenvironment[J]. Blood，2006，107(5):1761-1767.

[11]Pablos JL，Amara A，Bouloc A，et al. Stromal-cell derived factor is expressed by dendritic cells and endothelium in human skin[J]. Am J Pathol， 1999， 155(5):1577-1586.

[12]Cotsarelis G，Kaur P，Dhouailly D，et al. Epithelial stem cells in the

[13]Salcedo R，Wasserman K，Young HA，et al. Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor induce expression of CXCR4 on human endothelial cells: In vivo neovascularization induced by stromal-derived factor-1alpha[J]. Am J Pathol，1999，154(4):1125-1135.

[14]Grunewald M，Avraham I，Dor Y，et al. VEGF-induced adult neovascularization: recruitment， retention，and role of accessory cells[J]. Cell，2006，124(1):175-189.

[15]Toksoy A，Muller V，Gillitzer R，et al. Biphasic expression of stromal cell-derived factor-1 during human wound healing[J]. Br J Dermatol，2007，157(6):1148-1154.

[16]Florin L，Maas-Szabowski N，Werner S，et al. Increased keratinocyte proliferation by JUN-dependent expression of PTN and SDF-1 in fibroblasts[J]. Cell Sci，2005，118(Pt 9):1981-1989.

[收稿日期]2010-06-10[修回日期]2010-07-12

編輯/張惠娟