白藜蘆醇對模擬日光照射后黑素和朗格漢斯細(xì)胞的影響

[摘要]目的:觀察白藜蘆醇對模擬日光照射后黑素和朗格漢斯細(xì)胞的影響。材料和方法:招募11名健康女性志愿者，在每位志愿者背部選取6個非曝光部位。部位1～4分別涂抹白藜蘆醇+抗氧化劑、抗氧化劑、白藜蘆醇、基質(zhì)，30min后予1.5倍最小紅斑量的模擬日光照射，部位5僅予照射而不涂抹檢測物質(zhì)(陽性對照)，部位6既不照射亦不涂抹檢測物質(zhì)(陰性對照)。每天照射一次，連續(xù)照射4天。末次照射后24h對皮膚進(jìn)行取材，進(jìn)行Fontana Manna 染色及CD1a免疫組化染色。結(jié)果:陽性對照部位和涂抹基質(zhì)部位黑素含量指數(shù) (melanin content index，MCI) -目標(biāo)面積/場面積比值(%)及平均光密度值顯著上升，朗格漢斯細(xì)胞顯著減少;而雙側(cè)涂抹白藜蘆醇+抗氧化劑、抗氧化劑、白藜蘆醇的部位MCI-目標(biāo)面積/場面積比值(%)及平均光密度值輕度上升，朗格漢斯細(xì)胞輕度減少，與陽性對照部位和涂抹基質(zhì)的部位相比具有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論:聯(lián)合應(yīng)用白藜蘆醇和抗氧化劑或單獨應(yīng)用二者之一均可有效地防護(hù)模擬日光照射引起的黑素顆粒增加和朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量減少。

[關(guān)鍵詞]白藜蘆醇;模擬日光照射;黑素;朗格漢斯細(xì)胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)07-0999-04

Protective effects of resveratrol on melanin and Langerhans cells from solar simulator ultraviolet irradiation

JIA Li-li，LI Yuan-hong，WU Yan，ZHENG Ying-na，JIANG Li-li

(Department of Dermatology，No 1 Hospital of China Medical University，Key Laboratory of Immunodermatology，Ministry of Health (China Medical University) Shenyang 110001，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of resveratrol on melanin and Langerhans cells from solar simulator ultraviolet irradiation (ssUVR). Materials and MethodsEleven healthy female volunteers were enrolled in this study. Six sites on the non-exposed back skin were marked for the experiment. Sites 1～4 were applied with resveratrol (Res)+antioxidant (Aox)， antioxidant， resveratrol， vehicle， and followed by ssUVR at a dosage of 1.5 minimal erythema dose (MED) 30 min later. Site 5 received ssUVR without any test material(positive control)and site 6 received neither ssUVR nor test materials (negative control). The skin biopsies were taken 24 hours after the last ssUVR. The specimens were stained with Fontana Manna staining and immunohistochemistry staining of Monoclonal Antibody-CD1a. Results The measured percentage(%) and average optical density of MCI increased significantly on UV only site and Vehicle+UV site，much higher than on Res+Aox+UV site， Aox+UV site and Res+UV site (P<0.05). The density of Langerhans cells decreased dramatically on UV only and Vehicle+UV site， significant more than on Res+Aox+UV site，Aox+UV site and Res+UV site (P<0.05). Conclusions Resveratrol， antioxidant or their combination were effective in protecting the skin from ssUVR-induced melanin increase and Langerhans cells depletion .

Key words:resveratrol;solar simulator ultraviolet irradiation; melanin; Langerhans cell

過多地接觸紫外線輻射可引起皮膚曬傷、曬黑、皮膚光敏反應(yīng)、皮膚光老化甚至皮膚癌等，此外還可引起光性角膜炎，增加發(fā)生皮質(zhì)性白內(nèi)障、翼狀胬肉甚至眼黑色素瘤的危險性[1]。白藜蘆醇(resveratrol， Res)是植物界分布較廣的羥基二苯乙烯類化合物，主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、松樹等21個科，31個屬的72 種植物中，其中在新鮮葡萄皮中的含量最高[2]。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有多種藥理活性，如抗腫瘤[3]， 抗炎[4]、抗菌、抗氧化、抗自由基、肝臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、植物雌激素作用等。本研究旨在觀察白藜蘆醇是否對模擬日光照射(solar simulator ultraviolet irradiation， ssUVR)誘導(dǎo)的黑素增加及朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cell， LC)減少具有防護(hù)作用。

1材料和方法

1.1 志愿者:招募11名健康女性志愿者，每位志愿者均簽署了知情同意書。年齡45～58歲。入選標(biāo)準(zhǔn):無系統(tǒng)性疾病或皮膚病;未接受系統(tǒng)性治療及皮膚局部治療;無光敏史;非妊娠或哺乳婦女。試驗于2009年1～2月(北方冬季)進(jìn)行，以盡量減少外界環(huán)境中紫外線的影響[5]。

1.2試驗材料:①白藜蘆醇+抗氧化劑、抗氧化劑、白藜蘆醇、基質(zhì)均由雅詩蘭黛公司(美國紐約)提供?；|(zhì)霜為保濕霜，不含防曬劑，SPF值<1。抗氧化劑的成分為:抗壞血酸磷酸酯(0.1%)、維生素E醋酸酯(0.5%)、紫錐菊提取物 (0.01%)、洋甘菊提取物(0.12%)、咖啡因(0.18%);②碘、碘化鉀、10%硝酸銀、濃氨水、核固紅、硫酸鋁、0.1%氯化金、5%硫代硫酸鈉、鼠抗人CD1a單克隆抗體、二步法免疫組化檢測試劑盒、濃縮型DAB試劑盒。

1.3 實驗儀器:日光模擬器(GS2006 3.0E版，中國計量科學(xué)研究院，北京)，包括一個450W的氙燈加上一個WG320 濾光片(Schott，Clichy，F(xiàn)rance)，光線輸出模擬連續(xù)的290 nm 至400nm 的日光紫外線輸出，可發(fā)射出15倍太陽光強(qiáng)度的模擬日光。

1.4 實驗方法:①試驗開始前測定每位志愿者M(jìn)ED;②在志愿者背部6個部位進(jìn)行如下操作:部位1～4分別涂抹白藜蘆醇+抗氧化劑、抗氧化劑、白藜蘆醇、基質(zhì)30min后予1.5倍MED的ssUVR，部位5僅予照射而不涂抹檢測物質(zhì)(陽性對照)，部位6既不照射亦不涂抹檢測物質(zhì)(陰性對照)。詳見表1。各照光部位每日照射1次，連續(xù)照射4天。末次照射后24h對受試部位皮膚取材，用10%甲醛固定后行石蠟切片，進(jìn)行Fontana Manna 染色及CD1a免疫組化染色。

1.5染色方法

1.5.1Fontana Manna染色:①切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各濃度乙醇至水洗;②蒸餾水清洗5min×2次;③將切片置于GRAM液中10min;④用蒸餾水徹底清洗1h;⑤將切片置于FONTANA染液中，避光放置24h。蒸餾水清洗5min×2次;⑥在切片上滴加0.1%氯化金30μl，4min，蒸餾水清洗5min×2次;⑦5%硫代硫酸鈉固定2min，蒸餾水清洗5min×2次;⑧ 過濾好的KERNECHTROT染液，染色5min;⑨乙醇、二甲苯脫水、透明。中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.5.2CD1a免疫組化染色(S-P法):①切片常規(guī)用二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水;②置于pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液中，121。C蒸汽高壓消毒箱內(nèi)抗原熱修復(fù)10min;③自然冷卻后，3%H2O2去離子水孵育5～10min。PBS沖洗，2min×3次;④滴加一抗，4℃冰箱過夜。PBS沖洗，2min×3次;⑤滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育30min;PBS沖洗，2min×3次;⑥顯微鏡下控制DAB顯色，大約5～20min。蒸餾水沖洗;⑦蘇木素復(fù)染;⑧乙醇、二甲苯脫水、透明，中性樹膠封片。

1.6結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):①MCI:使用Image-Pro-Plus 6.0多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)，對Fontana Manna法染色切片進(jìn)行MCI計數(shù);每張切片連續(xù)選取10個非重疊視野，測定受檢基底層和棘細(xì)胞層內(nèi)黑素顆粒面積占該處表皮基底層和棘細(xì)胞層總面積的百分比及平均光密度值;②朗格漢斯細(xì)胞:于400倍光鏡下，每張切片連續(xù)選取10個非重疊視野計數(shù)朗格漢斯細(xì)胞總數(shù)。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析:采用16.0版SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1黑素:經(jīng)過1.5倍MED的模擬日光連續(xù)照射4次后，各照光部位MCI-目標(biāo)面積/場面積比值(%)及平均光密度值不同程度降低，其中陽性對照部位(部位5)和涂抹基質(zhì)部位(部位4)MCI-目標(biāo)面積/場面積比值(%)及平均光密度值顯著下降，而涂抹白藜蘆醇+抗氧化劑(部位1)、抗氧化劑(部位2)、白藜蘆醇(部位3)的部位MCI-目標(biāo)面積/場面積比值(%)及平均光密度值輕度下降，與陽性對照部位和涂抹基質(zhì)的部位相比具有顯著差異。見圖1～3。

2.2朗格漢斯細(xì)胞:經(jīng)過1.5倍MED的模擬日光連續(xù)照射4次后，各照光部位朗格漢斯細(xì)胞不同程度地減少，其中陽性對照部位(部位5)和涂抹基質(zhì)的部位(部位4)朗格漢斯細(xì)胞顯著減少，而涂抹白藜蘆醇+抗氧化劑(部位1)、抗氧化劑(部位2)、白藜蘆醇(部位3)的部位朗格漢斯細(xì)胞輕度減少，與陽性對照部位和涂抹基質(zhì)的部位相比具有顯著差異。詳見圖4和圖5。

3討論

有文獻(xiàn)報道紫外線照射是導(dǎo)致皮膚色素沉著的最強(qiáng)的刺激因素之一[7]。紫外線照射后表皮基底層黑素細(xì)胞中的酪氨酸氧化酶活性增加，促使新的黑色素合成，黑素在黑素細(xì)胞體內(nèi)合成后以黑素小體的形式傳遞到周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞并在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)重新分布和降解，從而起到調(diào)節(jié)皮膚顏色、抑制紫外線輻射的作用，此過程被稱為黑素傳遞。黑素傳遞過程通過調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞中傳遞的黑素小體的大小、數(shù)量和分布從而影響著人的皮膚顏色[8]。既往研究表明白藜蘆醇很可能是蛋白質(zhì)底物的一種競爭性抑制劑，無論順式還是反式結(jié)構(gòu)都具有明顯的酪氨酸蛋白激酶抑制活性[9]，從而抑制黑素合成，阻止皮膚變黑。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過1.5倍最小紅斑量的模擬日光連續(xù)照射4次后，各照光部位黑素不同程度增加，其中陽性對照部位和僅涂抹基質(zhì)部位增加最為顯著，而涂抹白藜蘆醇聯(lián)合抗氧化劑和僅單獨涂抹白藜蘆醇或抗氧化劑的部位相對增加較少，提示聯(lián)合外用白藜蘆醇和抗氧化劑或單獨外用二者之一均能有效地防護(hù)模擬日光照射誘導(dǎo)的黑素增加。

朗格漢斯細(xì)胞是表皮內(nèi)的抗原遞呈細(xì)胞，在皮膚免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。大量研究證實紫外線照射可導(dǎo)致表皮內(nèi)免疫遞呈細(xì)胞- 朗格漢斯細(xì)胞減少或衰竭，從而導(dǎo)致免疫抑制甚至皮膚癌的發(fā)生[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1.5倍最小紅斑量的模擬日光連續(xù)照射4次后，各照光部位朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量明顯減少，這與以往研究結(jié)果相符[11]，其中陽性對照部位和僅涂抹基質(zhì)部位減少最為顯著，而涂抹白藜蘆醇聯(lián)合抗氧化劑和僅單獨涂抹白藜蘆醇或抗氧化劑的部位減少相對較少，提示聯(lián)合外用白藜蘆醇和抗氧化劑或單獨外用二者之一均能有效地防護(hù)模擬日光照射誘導(dǎo)的朗格漢斯細(xì)胞減少。

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[收稿日期]2010-04-22 [修回日期]2010-06-30

編輯/張惠娟