NF-κB p65在人難愈合創(chuàng)面肉芽組織及增生性瘢痕中的表達和意義

[摘要]目的:本研究擬觀察NF-κB信號傳導通路關(guān)鍵基因p65在人難愈合創(chuàng)面肉芽組織、不同時間階段的增生性瘢痕以及正常皮膚標本的表達水平是否存在差異及關(guān)系。方法:收集臨床標本40例為實驗組，其中難愈合創(chuàng)面肉芽組織(A組)、半年內(nèi)增生性瘢痕(B組)、半年至1年增生性瘢痕(C組)、一年以上增生性瘢痕(D組)組織各10例，收集正常皮膚組織標本8例為對照組(E組)。采用組織免疫化學方法、實時熒光定量RT-PCR和Western blot技術(shù)分析檢測各標本中NF-κB p65表達。結(jié)果:免疫組化SP法染色B、C、D組中表達陽性，尤其是在B組中皮膚基底細胞層細胞陽性表達尤為明顯。RT-PCR檢測中，各組間均無顯著的統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但從各組均數(shù)來看，B、C、D組處于較高水平(B組為0.44，C組為0.46，D組為0.47)，數(shù)值相近，并且有高于E組和A組的趨勢(A組為0.38，E組為0.30)。Western blot 檢測中B、C、D組的蛋白表達水平明顯要高于A組和E組(P<0.05)。結(jié)論:①在難愈合創(chuàng)面肉芽組織中NF-кB p65表達水平較低，表明難愈合創(chuàng)面肉芽組織中細胞凋亡增強，抗凋亡水平受到抑制，組織難以愈合;②在增生性瘢痕早期(半年內(nèi))中，NF-кB p65的表達明顯增強，表明在增生性瘢痕早期瘢痕組織凋亡作用降低，抗凋亡作用明顯增強，瘢痕組織表現(xiàn)出明顯的增生作用;NF-κB p65皮膚基底細胞層細胞陽性表達尤為明顯，表明NF-кB p65可能在增生性瘢痕增生中發(fā)揮著重要作用，對增生性瘢痕凋亡有著強有力的抑制作用，促進了增生性瘢痕增生;③在增生性瘢痕后期(半年至1年)，NF-кB p65的表達仍高于正常皮膚，表明在增生性瘢痕后期細胞凋亡水平較低，抗凋亡水平較高，仍有組織增生;④在增生性瘢痕成熟期(1年后)，NF-кB p65表達水平接近正常皮膚。瘢痕組織凋亡作用增強，增生減弱，變得平坦和消退。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕;核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB;凋亡;肉芽組織

[中圖分類號]R619+.6[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)07-1009-04

Expression and significance of NF-κB in human chronic granulation tissue and

hypertrophic scar

LI Qiang1，XU Xiao-qun2，LI Zhe3，CAI Jing-long4

(1.Department of Burn Plastic Surgery， Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250021， Shandong，China; 2. Institue of Basic Medicine，Shandong Academy of Medical Science， Jinan 250062， Shandong，China; 3. Department of Pathology， Jinan Central Hospital， Jinan 250011， Shandong，China; 4. The 16th Department，Plastic Surgery Hospital， CAMS， Beijing 100144，China)

Abstract:ObjectiveThis study was to collect the clinical chronic granulation tissue， hypertrophic scars and normal skin samples to observe the p65 gene in NF-κB signaling pathway key organizations in different stages the level of signaling expressed by the existence of differences.MethodsThe collection of clinical specimens，including 40 cases of various stages，10 cases each group of human chronic granulation tissue，hypertrophic scars，and 8 cases of normal skin. Using immunohistochemistry，Real-time quantitative RT-PCR testing and Western blot to detect .Experimental group: Group A for the chronic granulation tissue，hypertrophic scars six months for group B， six months to one year for hypertrophic scars for Group C，more than a year hypertrophic scars for the group D， the control group of normal skin group for the group E.ResultsImmunohistochemical staining SP method shows F-κB p65 expression in Groups B，C，D expressed positive. In particular， noted that the NF-κB p65 in Group B in basal layer of skin is particularly positive. RT-PCR NF-кB p65 activity levels were compared between the groups was no significant difference (P>0.05). However，Groups B，C，D are similar，and there is higher than that of Group E and Group A. Western blot test results NF-кB p65 in B group，C group，D group of protein expression levels were significantly higher than that of group A and E group (P<0.05).Conclusion①In the chronic granulation tissue， NF-кB p65 no significant changes in the chronic granulation tissue showed that apoptosis increased，the level of anti-apoptosis is inhibited， the organization difficult to heal. ②In the early hypertrophic scars (in six months)，NF-кB p65 expression was significantly increased. Skin significantly enhance the role of anti-apoptosis，and apoptosis decreased significantly the performance of scar tissue hyperplasia role. As the basal cell layer of skin has the ability to split activly，which showed that NF-кB p65 may be in the proliferation of skin plays an important role in apoptosis of the skin has a strong inhibitory effect on skin，and plays an important role in proliferation. ③In the latter of hypertrophic scars (6 months to 1 year )， NF-кB p65 expression was still higher than normal skin， show that in the latter part of hypertrophic scars still hyperplasia.④In the mature hypertrophic scars (after 1 years)， NF-кB p65 expression levels close to normal skin. Scar tissue to strengthen the role of apoptosis， proliferation weakened，HS become flat and faded.

Key words: hypertrophic scars; NF-kappa B; apoptosis; chronic granulation tissue

NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路貫穿于創(chuàng)傷修復與愈合的整個生物學過程。NF-k B存在于幾乎所有類型的組織和細胞，是一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，是由Rel/NF-kappaB家族的多肽成員所形成的一組二聚體形式的轉(zhuǎn)錄因子的統(tǒng)稱，因能與B細胞免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子序列的B點位特異結(jié)合而得名[1]。以p50/p65異源二聚體最先確認并最常見。NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，活化后通過調(diào)節(jié)許多細胞因子、趨化因子、生長因子、粘附分子及多種酶的基因表達，對細胞內(nèi)許多基因的表達起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，參與細胞生長、發(fā)育、凋亡等多種生理功能，并在細胞惡性轉(zhuǎn)化、纖維化等方面起重要作用[2-3]。越來越多的研究表明許多疾病的發(fā)生和發(fā)展都與NF-κB的過度活化有關(guān)。而NF-κB中p65表達將阻止凋亡并提高TRAIL治療細胞中的NF-кB的活性。許多抗腫瘤藥物因能使NF-κB活化而使得許多腫瘤細胞產(chǎn)生藥物抗性[4-5]。

1材料和方法

1.1 實驗材料及標本采集、處理及分組:收集山東大學附屬省立醫(yī)院燒傷整形美容外科手術(shù)切除的難愈合創(chuàng)面肉芽組織及增生性瘢痕組織40例以及正常皮膚8例，年齡2～42歲，平均22.7±10.60歲，其中女性15例，男性33例。其中，難愈合創(chuàng)面肉芽組織及增生性瘢痕病因如下:火焰燒傷為12例，熱液燒傷為10例，化學燒傷為7例，外傷為6例，其它5例。難愈合創(chuàng)面肉芽組織為上述原因?qū)е?～2個月尚未愈合的創(chuàng)面10例。增生性瘢痕位于面頸部5例、軀干10例，上肢8例，下肢7例。3～6個月內(nèi)增生性瘢痕10例，0.5～1年增生性瘢痕10例，1～3年增生性瘢痕10例。臨床收集標本，每份標本分為兩部分，分別用于病理免疫組化檢測和轉(zhuǎn)錄、翻譯水平等檢測，組織保存于液氮。

實驗分組情況，難愈合創(chuàng)面肉芽組織為A組，半年內(nèi)增生性瘢痕為B組，半年至1年增生性瘢痕為C組，1年以上增生性瘢痕為D組，對照組正常皮膚組為E組。

1.2 主要試劑:硝酸纖維素雜交膜:SS公司產(chǎn)品，1kb DNA Marker:MBI，丙烯酰胺(上海生工生物工程公司)，1g N，N'-亞甲雙丙烯酰胺(Promega公司產(chǎn)品)，NF-κB p65 兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling 技術(shù)公司、酶標二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體)購自北京中山金橋(美國SantaCruz Biotechnology， INC)。

1.3 常規(guī)HE、免疫組化染色:常規(guī)HE染色:取材組織塊，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，脫蠟，染液染色，封片。免疫組織化學染色S-P法:4μm的組織切片脫蠟、水化;3%雙氧水室溫孵育;蒸餾水洗;PBS洗;正常血清(1:10)濕盒孵育;滴加一抗，置濕盒中室溫孵育;PBS洗;滴加生物素標記的二抗工作液置濕盒孵育;PBS洗;滴加鏈霉親和素過氧化物酶復合物工作液室溫孵育;PBS洗;DAB顯色5～10min，在顯微鏡下掌握染色程度;再水洗復染脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢。

1.4 RT-PCR檢測NF-κB p65mRNA表達:根據(jù)文獻[6]，設(shè)計合成NF-κB p65及內(nèi)參照β-actin的引物各一對，序列如下:

NF-κB p65上游引物P1:5'-TGCTGTGCGGCTCTGCTTCC-3'

下游引物P2:5'-AGGCTGGGGTCTGCGTAGGG-3;

β-actin 上游引物P1:5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3'

下游引物P2:5′-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC -3′。

擴增的片段分別為321bp和539bp。上述引物均由美國Invitrogen生物公司合成。

首先對實驗所用物品去Rnase處理。再對各樣本組織標本的組織及細胞總RNA進行提取，然后進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應和聚合酶鏈反應(PCR)。RT反應條件如下:快速離心混勻;37℃ 1h，95℃ 10min滅活M-MLV;快速離心使蒸汽沉于管底。PCR反應條件快速離心混勻;95℃ 5min，冰浴冷卻，然后快速離心使蒸汽沉于管底。加入1μl(1U/μl) Taq DNA聚合酶，快速離心混勻，加入30μl液體石蠟。循環(huán)條件:94℃ 1min;58℃ 1min;72℃ 1min;共35個循環(huán)，最后72℃延長7min。電泳鑒定。

將凝膠電泳圖像輸入美國Kodak凝膠分析系統(tǒng)，應用1D Image Analysis Software進行表達強度分析，按下公式計算相對系數(shù)。相對系數(shù)=細胞因子表達強度/-actin表達強度。

1.5 Western blot檢測NF-κB p65蛋白表達:本試驗應用蛋白提取液(含蛋白酶抑制劑10%)抽提各個實驗組織的總蛋白，可以有效抑制蛋白降解。應用蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠電泳方法及Western Blot方法。將SDS-PAGE凝膠電泳完畢，小心取下凝膠，轉(zhuǎn)膜，洗膜后，將NC膜置于平皿或小袋中，加入適當稀釋的一抗(兔抗人MICA多抗)，再洗膜;加入適當稀釋的酶標二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體)，再洗膜后顯色，直至顯色效果滿意為止，立即將膜置于雙蒸水中終止反應。

1.6 統(tǒng)計學分析:全部實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0醫(yī)學統(tǒng)計學軟件進行分析，各組樣本的凋亡水平均以均數(shù)±標準差(x ±s)。多組均數(shù)比較進行一維方差分析(One way ANOVA)， P<0.05作為差異顯著性界值。

2結(jié)果

2.1 HE染色觀測各組樣本病理學形態(tài)

2.1.1 E組鏡下可見表皮層次清楚，角化層角化明顯，皮膚附屬器豐富，包括汗腺、皮脂腺、毛囊等結(jié)構(gòu)。膠原纖維束排列規(guī)則，少而疏松、卷曲，細胞較少(圖1-1)。

2.1.2 A組鏡下可見大量由內(nèi)皮細胞增生形成的實性細胞索及擴張的毛細血管，向創(chuàng)面垂直生長;在毛細血管周圍有許多新生的成纖維細胞，呈圓形，增生的成纖維細胞散在分布于毛細血管網(wǎng)絡(luò)之間，很少有膠原纖維形成;多少不等的炎性細胞浸潤于難愈合創(chuàng)面肉芽組織之中(圖1-2)。

2.2.3 B組鏡下可見表皮覆蓋創(chuàng)面，但鱗狀上皮薄，基底層增生較活躍，表層上皮細胞未見明顯角化。許多成纖維細胞，呈扁圓形，有網(wǎng)狀纖維及膠原纖維增多，網(wǎng)狀纖維有膠原化，皮下膠原較旺盛，粗大，排列紊亂;間質(zhì)中炎性細胞少見;可見少量毛細血管(圖1-3)。

2.2.4 C組鏡下可見表面鱗狀上皮基底層、棘層及角化層層次較清楚，可出現(xiàn)較少角化現(xiàn)象。網(wǎng)狀纖維及膠原纖維增多，網(wǎng)狀纖維膠原化，皮下膠原纖維較前變細，排列規(guī)則，部分呈玻璃樣變性;成纖維細胞減少或消失，僅見少量纖維細胞，呈細長;間質(zhì)中炎性細胞消失;毛細血管閉合、退化、消失，可見稀少的小動脈及小靜脈(圖1-4)。

2.2.5 D組鏡下可見鱗狀上皮層次清楚，出現(xiàn)角化，但仍比正常鱗狀上皮薄，無腳突，無皮膚附屬器。皮下膠原細、少，排列更規(guī)則，呈玻璃樣變性;僅見少量纖維細胞，細長;間質(zhì)中炎性細胞消失;僅見稀少的小動脈及小靜脈(圖1-5)。

2.2 免疫組化SP法檢測NF-κB p65表達及分布

2.2.1 NF-кB p65正常時主要位于細胞漿，當激活時轉(zhuǎn)移至細胞核才能發(fā)揮其生物學作用。E組可見正常皮膚表現(xiàn)為表皮基底層、成纖維細胞細胞漿呈淡黃色，細胞核無黃染，在細胞上基底層，部分細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃染成纖維細胞基本無陽性表現(xiàn)，呈細長，背景清晰無非特異性著色。組織中膠原纖維無著色(圖2-1)。

2.2.2 A組可見成纖維細胞偶見陽性表現(xiàn)，呈圓形，背景清晰無非特異性著色。組織中膠原纖維無著色(圖2-2)。

2.2.3 B組可見成纖維細胞均勻著色的棕黃色顆粒，較多，呈圓形，背景清晰無非特異性著色。組織中膠原纖維無著色(圖2-3)。

2.2.4 C組可見細胞陽性率下降，纖維細胞仍有著色，藍色核染增多，背景清晰無非特異性著色。而細胞減少，瘢痕組織中大量膠原纖維無著色(圖2-4)。

2.2.5 D組可見細胞陽性率偶見，成熟的纖維細胞胞漿內(nèi)未見棕黃色顆粒，呈細長，背景清晰無非特異性著色。組織中膠原纖維無著色(圖2-5)。

尤其注意的是在瘢痕增生早期組織中，可見表皮鱗狀細胞層菲薄，而在瘢痕皮膚基底細胞層細胞有大量均勻著色的棕黃色顆粒，而相比較在皮膚其它各層卻鮮見(圖3)。

2.3 RT-PCR檢測組織NF-кBp65的表達:NF-кB p65活性水平各組間比較差異無顯著的統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(表1，圖4)。但從各組均數(shù)來看，E組和A組處于較低水平(A組為0.38，E組為0.30)。B、C、D組處于較高水平(B組為0.44，C組為0.46，D組為0.47)，數(shù)值相近，并且有高于E組和A組的趨勢。

2.4 Western blot檢測NF-кBp65的表達:NF-кB p65在A組和E組中蛋白表達水平差異沒有顯著地統(tǒng)計學意義(P>0.05)，B組、C組、D組的蛋白表達水平明顯要高于A組和E組(P<0.05)(圖5)。

3討論

有兩條不同的信號通路參與調(diào)控TRAIL誘導細胞凋亡的胞內(nèi)途徑[7]，其一是通過半胱天冬蛋白酶(Caspase)傳導凋亡信號，稱為Caspase通路，其二是通過活化NF-κB進行基因誘導調(diào)控。死亡受體DR4、DR5可經(jīng)TRADD活化NF-κB，而NF-κB活化后又通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)TRAIL引起的凋亡。抑制TRAIL誘導的NF-κB活化可增強TRAIL誘導的凋亡，并減弱細胞對TRAIL誘導凋亡的抵抗力。與正常皮膚相比較，NF-κB P65蛋白水平在瘢痕疙瘩組織中表現(xiàn)為靜息水平的高表達，其持續(xù)活化促進cyclinD1的表達，導致成纖維細胞的異常增殖，合成過量膠原，造成細胞外基質(zhì)的異常堆積[8]。

在本實驗中，NF-кB p65在難愈合創(chuàng)面肉芽組織中與正常皮膚組織中沒有太大變化，在增生性瘢痕各階段中，NF-кB p65的表達是高于正常皮膚和難愈合創(chuàng)面肉芽組織的趨勢，而在難愈合創(chuàng)面肉芽組織與正常皮膚中處于較低表達水平的趨勢。并結(jié)合免疫組織化學染色和western blot的實驗結(jié)果，可以較明顯看出NF-кB p65此趨勢。而出現(xiàn)本實驗RT-PCR的統(tǒng)計學結(jié)果，考慮臨床增生性瘢痕的取材增生情況復雜，增生狀態(tài)跨度大，增加樣本量可能有較好的統(tǒng)計學結(jié)果。

在免疫組化瘢痕增生早期(半年內(nèi))組織中可見在瘢痕皮膚基底細胞層有大量均勻著色的棕黃色顆粒，而在皮膚其它各層卻少見著色的棕黃色顆粒。由于皮膚基底細胞層有活躍的分裂能力，是表皮各層細胞的生發(fā)之源，這表明NF-кB p65可能在皮膚增生中發(fā)揮著重要作用，對皮膚凋亡有著強有力的抑制作用，對皮膚增生起著重要作用。NF-кB是抑制凋亡的中介者，它的激活通過抑制細胞因子caspase-8活性啟動來提高抗凋亡細胞和組織的閾值。本實驗研究率先檢測了NF-кB p65在難愈合創(chuàng)面肉芽組織及增生性瘢痕中不同增生階段的表達，提示了NF-кB p65凋亡調(diào)控極有可能參與難愈合創(chuàng)面肉芽組織異常凋亡增強和瘢痕增生中異常凋亡降低，對難愈合創(chuàng)面肉芽組織的修復和治療瘢痕增生及其治療時機提供了理論基礎(chǔ)依據(jù)。

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[收稿日期]2010-03-28 [修回日期]2010-06-21

編輯/張惠娟