脂肪來(lái)源干細(xì)胞在脂肪移植中的作用及其臨床應(yīng)用進(jìn)展

長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)于各種原發(fā)的和繼發(fā)的軟組織缺損的治療一直是困擾整形外科醫(yī)生的難題之一。自體脂肪作為一種軟組織填充物，由于其諸多的并發(fā)癥曾一度被人們放棄，但隨著組織工程技術(shù)及細(xì)胞生物學(xué)的不斷發(fā)展，自體脂肪移植又逐漸被人們認(rèn)可?，F(xiàn)將脂肪干細(xì)胞在脂肪移植中的作用及其臨床應(yīng)用現(xiàn)狀綜述如下。

1脂肪移植的發(fā)展概況

20世紀(jì)初，自體顆粒脂肪移植開(kāi)始應(yīng)用于臨床，由于其吸收率高、存活率低，且并發(fā)癥較多，限制了其在臨床中的應(yīng)用。21世紀(jì)初，通過(guò)改進(jìn)脂肪獲取技術(shù)，加速了脂肪血管化，提高了脂肪顆粒移植的成活率。但是壞死、吸收仍然是顆粒脂肪移植的主要并發(fā)癥。1998年，Coleman發(fā)明了結(jié)構(gòu)脂肪(liposuction)移植技術(shù)，即在脂肪移植的整個(gè)過(guò)程中保證脂肪細(xì)胞具有更多的完整性和活性，也就是后來(lái)所說(shuō)的Coleman技術(shù)，使脂肪移植的存活率有了很大的提高。而自Zuk等[1]首次從自體脂肪組織中分離獲得具有多向分化潛能的細(xì)胞—脂肪來(lái)源干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，ASCs)以來(lái)，其研究越來(lái)越深入，因?yàn)槠鋪?lái)源豐富，取材方便，且組織中干細(xì)胞含量豐富，因而ASC被認(rèn)為是組織再生和修復(fù)的理想細(xì)胞來(lái)源，可為多種疾病的治療提供充足的種子細(xì)胞[2]。近年來(lái)，隨著組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為克服常規(guī)注射顆粒脂肪移植的問(wèn)題，如吸收、囊腫、硬結(jié)等，Yoshimura等[4]又發(fā)明了細(xì)胞輔助的脂肪移植術(shù)(cell-assisted lipotransfer，CAL)，為脂肪移植提供了一種更為可靠的方法。該技術(shù)是將自體脂肪來(lái)源干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，ASCs)與脂肪細(xì)胞混合，聯(lián)合注射移植。

2脂肪移植中的細(xì)胞基礎(chǔ)

脂肪組織通常被認(rèn)為是貯存能量及內(nèi)分泌器官，是軟組織填充和吸脂處理的必要組織。同時(shí)還被認(rèn)為是成體干細(xì)胞的有效來(lái)源，因?yàn)橹窘M織含有多種的祖細(xì)胞，可分化為多種譜系[3]。脂肪組織中主要包含脂肪細(xì)胞、ASCs、血管內(nèi)皮細(xì)胞、壁細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等[4]，其中脂肪細(xì)胞和ASCs是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。脂肪細(xì)胞是脂肪組織的基礎(chǔ)，其體積占總體積的90%以上，但數(shù)量卻少于50%[5-6]。ASCs被認(rèn)為是一種表現(xiàn)脂肪細(xì)胞和血管細(xì)胞的祖細(xì)胞[7]，它位于脂肪細(xì)胞之間、血管周圍或細(xì)胞外基質(zhì)中，可促進(jìn)脂肪組織的轉(zhuǎn)歸[8]。但脂肪組織的轉(zhuǎn)歸是一個(gè)很漫長(zhǎng)的過(guò)程，成年人平均每年大約有10%左右的脂肪細(xì)胞被更新[8-9]，而ASCs又存在于脂肪組織的間質(zhì)血管碎片中(stromal vascular fraction，SVF)[10]。間質(zhì)血管碎片(SVF)是干細(xì)胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過(guò)膠原酶消化，從脂肪組織中分離的多種細(xì)胞混合物形成的細(xì)胞團(tuán)就叫做間質(zhì)血管碎片(SVF)。間質(zhì)血管碎片中含有豐富的間充質(zhì)細(xì)胞，可分化為多種譜系的細(xì)胞，是再生醫(yī)學(xué)、組織工程等最理想的種子細(xì)胞。獲取SVF的方法主要是[5]將吸脂后的脂肪用PBS (phosphate-buffered saline)反復(fù)沖洗兩次，然后在37℃條件下用0.075%的膠原酶消化30min，再用含10%胎牛血清的DMEM終止消化，1200g離心10min后就會(huì)獲得高密度的SVF碎片[1]。其中主要包括間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞。另外， SVF中也包括一些血管來(lái)源的細(xì)胞，如白細(xì)胞和紅細(xì)胞等，而血管來(lái)源細(xì)胞的比率主要取決于個(gè)體出血的多少。在CAL中，不需經(jīng)過(guò)人工的分選及培養(yǎng)，直接將分離的新鮮的自體SVF用來(lái)做脂肪移植補(bǔ)充物[11-12]。另外，有研究指出新鮮分離的脂肪干細(xì)胞與培養(yǎng)增殖的干細(xì)胞相比可能在治療方面更具有安全性和有效性[4，13]?，F(xiàn)在正在進(jìn)行的一些臨床試驗(yàn)也經(jīng)常應(yīng)用新鮮分離的SVF，而不是純化或培養(yǎng)的ASCs。因?yàn)镾VF包含其他細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等，許多研究發(fā)現(xiàn)它們之間有一種協(xié)同效應(yīng)[14-16]。

3ASCs在脂肪移植中的作用

脂肪移植后脂肪組織的存活和萎縮的機(jī)制并未得到證明。移植后無(wú)微血管的脂肪組織被安置于異位組織中—相對(duì)缺血區(qū)，最初幾天的營(yíng)養(yǎng)灌注來(lái)自于宿主組織周圍組織，直到形成新的微血管。對(duì)于損傷的反應(yīng)，損傷的宿主組織，特別是細(xì)胞外基質(zhì)和死亡的細(xì)胞會(huì)釋放FGF[16]。在修復(fù)過(guò)程中，脂肪細(xì)胞(對(duì)缺氧很敏感)在氧壓低于其閾值的情況下24h內(nèi)可能死亡。但是ASCs更能耐受缺氧，其在缺氧情況下可保持功能72h[17]。在動(dòng)物模型的缺血再灌注損傷的脂肪組織中，ASCs在脂肪移植的修復(fù)過(guò)程中及在脂肪化和血管化中起著重要的作用[18]，其可調(diào)節(jié)周圍組織中生長(zhǎng)激素及細(xì)胞因子的釋放[19]，并通過(guò)分泌各種生長(zhǎng)因子如VEGF，IGF-1防止細(xì)胞凋亡[20]，使脂肪組織的再生和凋亡達(dá)到平衡。

ASCs存在于脂肪細(xì)胞之間、血管壁、結(jié)締組織中，但大部分聚集在血管周圍。其在缺氧條件下可釋放血管形成因子[21-22]，并可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞[23-24]，表現(xiàn)為成血管特性，成為治療局部缺血性疾病血管發(fā)生的最理想細(xì)胞來(lái)源。一些研究表明存在血管壁的細(xì)胞群落可分化為血管[25-26]。最近發(fā)現(xiàn)大鼠的脂肪祖細(xì)胞像血管管壁細(xì)胞一樣存在于脂肪組織的血管中[27]。因此，ASCs被認(rèn)為是一種脂肪細(xì)胞和血管細(xì)胞的雙重祖細(xì)胞。ASCs可為脂肪組織的轉(zhuǎn)歸和下一代的再生提供原始細(xì)胞，脂肪組織細(xì)胞凋亡后可被ASCs來(lái)源的下一代細(xì)胞取代[6-7]。脂肪組織會(huì)隨著發(fā)育、肥胖而增殖，也會(huì)隨著老齡化、缺血而發(fā)生萎縮，還可在損傷后修復(fù)、缺血再灌注的損傷及脂肪移植后起到塑形作用。發(fā)生這些塑形過(guò)程可能是因?yàn)橹炯?xì)胞的凋亡壞死和ASCs引起的脂肪化之間的失衡，在這些變化過(guò)程中同時(shí)也伴隨著微血管的重塑。同時(shí)，Caplan[28]也指出脂肪組織隨著年齡的增長(zhǎng)而萎縮可能由于ASCs的減少，凋亡和再生失去了平衡。一些前期的研究還發(fā)現(xiàn)即使存活的脂肪細(xì)胞在移植的最初幾個(gè)月內(nèi)也會(huì)發(fā)生死亡并被下一代細(xì)胞所取代，其原因可能由于局部缺血。因此，有功能的ASCs的數(shù)量可能在組織修復(fù)和塑形中具有重要作用。

4ASCs在細(xì)胞輔助的脂肪移植術(shù)(CAL)中的作用

CAL技術(shù)是將新抽取脂肪分成兩份:一份用來(lái)提取SVF，另一份作為提取的細(xì)胞外基質(zhì)，兩部分聯(lián)合注射于受區(qū)[12]。Sterodimas[10]指出吸脂的脂肪組織與完整脂肪組織相比， ASCs的數(shù)量只有原來(lái)的一半。其原因可能是因?yàn)橐徊糠諥SCs停留在大血管周圍或留在受體組織中，一部分ASCs釋放入吸脂脂肪的液體成分中[12]。這種低ASCs比率可能是移植的脂肪組織長(zhǎng)時(shí)間后萎縮的主要原因。最近的研究表明[10，29-30]脂肪來(lái)源干細(xì)胞輔助治療可提高存活脂肪組織的體積和質(zhì)地。在CAL中[31-32]，脂肪組織可作為有活力的生物支架，使新鮮的包含ASCs的SVF粘附于脂肪組織上，不僅增加了前體細(xì)胞的數(shù)量，還有利于組織血管的形成和ASCs向脂肪組織的轉(zhuǎn)歸，提高了脂肪組織的成活率。Yoshimura[32]認(rèn)為ASCs在CAL中的作用可能是:①分化成脂肪細(xì)胞并促進(jìn)脂肪再生;②分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞，以促進(jìn)血管化作用;③在缺氧、損傷等條件下可促進(jìn)血管生長(zhǎng)因子釋放，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)， 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1);④最有可能的就是ASCs作為原始的ASCs而成活。

5ASCs的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

Ogawa[33]指出干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用應(yīng)考慮三方面的因素:①如何在無(wú)損傷的條件下獲取、處理及增殖細(xì)胞，操作的簡(jiǎn)單性及高效性等;②如何使干細(xì)胞分化成所需細(xì)胞及如何建立起有效的三維組織結(jié)構(gòu);③如何保證分化后細(xì)胞的存活及組織的再生，因?yàn)榻M織再生必須具有一定的脈管系統(tǒng)來(lái)保證組織和分化后細(xì)胞的存活。而脂肪來(lái)源干細(xì)胞可分化為內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，促進(jìn)血管和脂肪組織的形成，并且來(lái)源豐富、操作簡(jiǎn)單，可滿足軟組織填充的基本要求。臨床前研究及早期的臨床研究也指出ASCs復(fù)合可注射型支架材料可作為軟組織填充物應(yīng)用于整形外科中[30]。目前，歐洲和亞洲已有許多國(guó)家已經(jīng)開(kāi)始利用人類ASCs構(gòu)建組織工程脂肪組織，用于修復(fù)軟組織的缺損。

Yoshimura[32]是首位將ASCs的臨床經(jīng)驗(yàn)公布的作者，2003～2008年，Yoshimura 等[34]利用細(xì)胞輔助的吸脂術(shù)進(jìn)行了臨床研究，共做了307例患者(女性303例、男性4例)，乳房手術(shù)269例(177例隆胸術(shù)，52例乳房植入物替代術(shù)和40例乳房切除術(shù)后再造)面部手術(shù)48例(3例紅斑狼瘡，2例Romberg病和1例硬皮病)，臀部4例，手部3例。結(jié)果顯示患者對(duì)移植后皮膚的自然紋理、柔軟度、軟組織填充后的塑形等都很滿意。3D檢測(cè)顯示隆胸后移植物存活率在40%～80%[31]，CT及MRI顯示脂肪組織存活很好，在乳房腺體周圍及腺體和胸肌之間形成了一定厚度的脂肪層。在面部脂肪萎縮的治療中，其有效性得到了充分的證實(shí)，另外，CAL在治療半側(cè)顏面萎縮及深部紅斑狼瘡中也有明顯的效果[34]。但是在臨床試驗(yàn)中，有2例患者注射SVF后3個(gè)月發(fā)生了異位的纖維組織形成，CT顯示皮下脂肪層中有纖維組織形成。這種結(jié)果可能由于微環(huán)境的變化使ASCs產(chǎn)生了非必要的細(xì)胞分化，Yoshimura [35]指出為了避免這種情況，ASCs盡量與脂肪組織充分粘附，使其向必需細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。在臨床上，ASCs也被應(yīng)用于治療其他疾病，如急性心肌梗死、周圍血管疾病、軟組織及骨骼的缺損、皮膚損傷等，結(jié)果表明都有很好的治療效果[38]。CAL也被應(yīng)用于放療后并發(fā)癥的治療，臨床結(jié)果顯示所有患者的癥狀都有明顯的改善，其原因可能是由于組織血管的形成和器官功能的恢復(fù)[37]。

綜上所述，新鮮分離的SVF含有豐富的脂肪來(lái)源干細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等前體細(xì)胞。在CAL中它與其他細(xì)胞相互影響并通過(guò)自分泌，分泌多種促血管化的細(xì)胞因子，可增加組織的血管化程度，改善移植物的質(zhì)地，極大地提高了脂肪移植的存活率。雖然自體脂肪移植的安全性和長(zhǎng)期有效性等有待進(jìn)一步的評(píng)估，其作用機(jī)制也有待進(jìn)一步的研究，但筆者相信由于SVF復(fù)合自體脂肪移植獨(dú)特的優(yōu)越性，其必將在整形美容外科領(lǐng)域成為一種理想的軟組織填充物。

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[收稿日期]2010-05-09[修回日期]2010-06-30

編輯/李陽(yáng)利