PPARγ激動(dòng)劑對(duì)成人正常皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用

[摘要]目的:觀察過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響，探討其抗瘢痕纖維化的潛在作用。方法:體外培養(yǎng)成人正常皮膚成纖維細(xì)胞，利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法觀察、分析PPARγ配體15-脫氧前列腺素J2(15d-PGJ2)及其激動(dòng)劑曲格列酮對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的α平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)的影響，利用Western blot、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測PPARγ激動(dòng)劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA蛋白及mRNA水平的影響。結(jié)果:TGF-β1能顯著增加成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞;與TGF-β1誘導(dǎo)組相比，10μM 曲格列酮、15d-PGJ2預(yù)處理組的α-SMA表達(dá)量顯著減少(P<0.01)，抑制效應(yīng)分別為31%、57%;預(yù)處理組的α-SMA mRNA水平顯著下降 (P<0.01)。結(jié)論:PPARγ激動(dòng)劑能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成人正常皮膚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化的效應(yīng)，具有抗皮膚瘢痕化、攣縮的潛在作用。

[關(guān)鍵詞]過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ);轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1);成纖維細(xì)胞;肌動(dòng)蛋白

[中圖分類號(hào)]R619+.6Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2010)07-1006-03

Effects of PPARγ agonists on TGF-β1-induced transdifferentiation in normal skin

fibroblasts in vitro

YANG Chong-zhi，ZHANG Hui-tang，WANG Gong-sheng，ZHOU Hai-quan，MA Chi，HU Da-hai

(Department of Burn Surgery， PLA322 Hospital，Datong037006，Shanxi，China)

Abstract: ObjectiveTo observe the effects of peroxisome prolilerator-activated receptor γ (PPARγ) agonists on TGF-β1-induced transdifferentiation of the cultured the normal skin fibroblasts in vitro，so as to explore its effects on inhibiting the formation of hypertrophic scars.MethodsIn cultured normal skin fibroblasts，the effects of both natural (15d-PGJ2) and synthetic (troglitazone) PPARγ agonists on the level of TGF-β1-indued α-smooth muscle actin expression were assessed by immunofluorescence and image analysis.The effects of PPARγ agonists on the level of α-smooth muscle actin expression induced by TGF-β1 were detected by Western blot.ResultsIn normal skin fibroblasts，TGF-β1 enhanced transdifferentiation of fibroblasts to myofibroblasts .The level of α-SMA expression in 15d-PGJ2 and troglitazone-pretreated groupsrespectively were significantly decreased compared with TGF-β1-stimulated group (P<0.01).ConclusionPPARγ agonists may inhibit the profibrotic activities of TGF-β1 on skin fibroblasts:myofibroblast differentiation . Thus PPARγ agonists have novel and potent antifibrotic effects in human skin fibroblasts and may have potential for therapy of hypertrophic scar.

Key words: peroxisome prolilerator-activated receptor γ(PPARγ);ttransforming growth factor-β1;fibroblasts;actins

在增生性瘢痕中存在著大量以α-SMA為細(xì)胞標(biāo)志物的肌成纖維細(xì)胞，它在超微結(jié)構(gòu)上兼有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特征[1]。TGF-β1作為致瘢痕的主要生長因子，可使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。TGF-β1在增生性瘢痕中的持續(xù)存在及過量表達(dá)可增加α-SMA的生成，從而加重瘢痕的增生和攣縮。最近研究表明，臨床上用于治療糖尿病的胰島素增敏劑PPARγ激動(dòng)劑具有拮抗TGF-β1的上述效應(yīng)[2-4]。本實(shí)驗(yàn)以正常皮膚成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，探討PPARγ激動(dòng)劑干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞α-SMA效應(yīng)的影響，從而揭示PPARγ拮抗TGF-β1促瘢痕纖維化、攣縮的作用。

1材料和方法

1.1 主要試劑及儀器:人類重組TGF-β1(Peprotech公司，美國)，15d-PGJ2、曲格列酮(Biomol公司，美國)，鼠抗人α-SMA單克隆抗體、辣根過氧化物酶-山羊抗小鼠IgG (Santa Cruz，美國)，兔抗鼠cy3-IgG(Sigma公司，美國)，IX71型倒置式顯微鏡(Olympus，日本)，TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、SYBR Green 熒光定量試劑盒(TaKaRa生物工程公司，日本)，DU800型分光光度計(jì)(Beckman Coulter，美國)，Real-Time PCR儀(Bio- Rad公司，美國)。

1.2成纖維細(xì)胞培養(yǎng):取整形手術(shù)中切下的多余正常皮膚組織(經(jīng)患者知情同意)，在無菌條件下漂洗、消毒。原代培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[5]組織塊法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)選用第3～6代細(xì)胞。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組加無血清DMEM培養(yǎng)基，干預(yù)組培養(yǎng)基依次為10ng/ml TGF-β1、10μM曲格列酮+10ng/ml TGF-β1、10μM15d-PGJ2+10ng/ml TGF-β1(藥物干預(yù)組為兩種藥物分別預(yù)處理2h，再加入10ng/ml TGF-β1處理48h)。

1.3.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法觀察α-SMA表達(dá):在6孔培養(yǎng)板內(nèi)制作細(xì)胞爬片，按實(shí)驗(yàn)分組加入培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù)。培養(yǎng)48h后取出細(xì)胞爬片，以cy3行免疫熒光染色，以DAPI復(fù)染核，其中鼠抗人α-SMA抗體稀釋度為1:200。熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)用美國Media Cybnetics公司的Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)爬片進(jìn)行圖像分析。

1.3.3 Western blot檢測α-SMA蛋白表達(dá):將各組細(xì)胞裂解液以BCA法進(jìn)行蛋白定量，取40μg總蛋白以SDS-PAGE分離，半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，以鼠抗人α-SMA單克隆抗體(稀釋比例1:500)作為一抗，4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(稀釋比例1:4000)作為二抗，室溫孵育2h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影。顯影底片經(jīng)Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，以內(nèi)參β-actin的吸光度(A)值為對(duì)照，其余電泳條帶的A值與之相比所得比值表示結(jié)果。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測α-SMA mRNA水平:細(xì)胞總RNA提取及mRNA反轉(zhuǎn)錄參照試劑說明書進(jìn)行。α-SMA上游引物:5′CAATGTCCCTGCCATGTACGTC 3'，下游引物:5′GGCAGGGCATAG-CCTTCATAGA 3′。反應(yīng)體系20 μl，含cDNA 5 ng，10 μl SYBR Green混合液，5 μmol/L 的引物1μl。采用Bio-Rad 的IQ5 系統(tǒng)進(jìn)行SYBR Green 熒光定量PCR 分析，結(jié)果采用IQ5 軟件行CT 值相對(duì)定量分析，以GAPDH 為內(nèi)參，每個(gè)樣品基因重復(fù)3管。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 x±s表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析行LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1PPARγ激動(dòng)劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響:免疫熒光染色結(jié)果顯示，α-SMA陽性表達(dá)為紅色熒光，DAPI復(fù)染后細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(圖1)。以圖像分析技術(shù)獲得對(duì)照組、TGF-β1誘導(dǎo)組、10μM曲格列酮、15d-PGJ2預(yù)處理組的光密度平均值分別為0.101±0.011、0.878±0.029、0.303±0.024、0.195±0.034，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，TGF-β1誘導(dǎo)組的α-SMA陽性表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)，而經(jīng)曲格列酮、15d-PGJ2分別預(yù)處理后其α-SMA表達(dá)明顯低于TGF-β1誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 PPARγ激動(dòng)劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA蛋白表達(dá)影響:與空白對(duì)照組相比，TGF-β1顯著增加α-SMA表達(dá)(P<0.01)。分別加入10μM曲格列酮、10μM 15d-PGJ2預(yù)處理2h，再加入10ng/ml TGF-β1作用48h，與TGF-β1處理組相比，α-SMA表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，其抑制效應(yīng)分別為31%、57%。15d-PGJ2干預(yù)組較曲格列酮干預(yù)組表達(dá)量明顯減少(P<0.05) (圖2)。

2.3PPARγ激動(dòng)劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA mRNA水平影響:與對(duì)照組相比，TGF-β1誘導(dǎo)組顯著增加α-SMA mRNA水平(P<0.05)。分別加入10μM曲格列酮、15d-PGJ2預(yù)處理2h，再加入10ng/ml TGF-β1作用48h后，與TGF-β1誘導(dǎo)組相比，各藥物干預(yù)組α-SMA mRNA水平顯著下降(P<0.01) (圖3)。

3討論

研究表明[6-7]，在增生性瘢痕中存在著大量以α-SMA為細(xì)胞標(biāo)志物的肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞比普通的成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖和分泌膠原的能力，并具有收縮性，其在時(shí)間與空間上的分布可影響傷口的收縮、瘢痕的形成。TGF-β1作為致瘢痕的主要生長因子，在增生性瘢痕中的持續(xù)存在及過量表達(dá)可增加α-SMA的生成，從而加重瘢痕的增生和攣縮。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法及Western blot檢測顯示，TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞后，α-SMA表達(dá)量均比空白對(duì)照組明顯增多(P<0.01)。肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量和功能狀態(tài)在很大程度上決定了瘢痕纖維化的速度和程度，因此，抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是抗瘢痕纖維化的主要策略之一[6-8]。

PPARγ是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，脂肪酸、花生酸類物質(zhì)和部分前列腺素如15d-PGJ2(15-deoxy-Δ12，14-prostaglandin J2)是其天然配體，胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥是其人工合成配體[9]。目前，PPARγ在抗器官纖維化方面的有效作用成為新的研究熱點(diǎn)。此類研究集中于抗內(nèi)臟器官的纖維化，尤以抑制腎小球硬化、肝硬化及肺纖維化研究較多[10-12]，但有關(guān)PPARγ激動(dòng)劑抗皮膚瘢痕化的研究還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，正常皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)10ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)后α-SMA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，在10μM曲格列酮、15d-PGJ2預(yù)處理后α-SMA表達(dá)顯著減少(P<0.01)，其抑制效應(yīng)分別為31%、57%。同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)的α-SMA，發(fā)現(xiàn)在mRNA水平、蛋白原位表達(dá)均有相同的變化趨勢(shì)。本研究結(jié)果提示，激活的PPARγ可拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，降低α-SMA的表達(dá)，PPARγ此效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)豐富了瘢痕增生攣縮的信號(hào)分子調(diào)控理論。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PPARγ激動(dòng)劑可有力拮抗TGF-β1誘導(dǎo)成人正常皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。提示PPARγ激動(dòng)劑在抗皮膚病理性瘢痕方面具有潛在的應(yīng)用前景，可能會(huì)成為臨床上防治病理性瘢痕的新途徑。

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[收稿日期]2010-04-06 [修回日期]2010-06-18

編輯/張惠娟