馬氏珠母貝高F值寡肽體外抗氧化研究

鄭惠娜章超樺吉宏武秦小明

（1.水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

馬氏珠母貝高F值寡肽體外抗氧化研究

鄭惠娜1，2章超樺1，2吉宏武1，2秦小明1，2

（1.水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

研究馬氏珠母貝高F值寡肽（PHFP）的體外抗氧化及其對(duì)H2O2誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明：馬氏珠母貝高F值寡肽對(duì)·OH、DPPH·及O－2·均具有一定的清除能力。在濃度為10mg/mL時(shí)，對(duì)3種自由基的清除率分別達(dá)到了60.8%、50.8%和44.2%。劑量為1mg/mL的高F值寡肽使H2O2誘導(dǎo)損傷L02肝細(xì)胞的半數(shù)致死劑量LD50由 損 傷 模 型 組 的0.618mmol/L 提 高 到0.737mmol/L，提高了19.3%。

馬氏珠母貝；高F值寡肽；抗氧化活性

高F值寡肽是由3～7個(gè)氨基酸殘基組成的混合小肽體系，具有高支低芳的氨基酸組成模式，可用于輔助治療肝性腦病、肝硬化、糾正血漿及腦中的氨基酸病態(tài)模式。1991年日本學(xué)者Soichi［1］研究證實(shí)了玉米高F值寡肽混合物能夠有效用于輔助治療肝臟疾病。中國(guó)學(xué)者王梅［2－3］首次對(duì)高F值寡肽進(jìn)行研究，隨后許多研究者也對(duì)高F值寡肽的抗疲勞，抗缺氧等活性進(jìn)行了研究［4－5］。由于具有高F值，高F值寡肽可以通過(guò)糾正血漿及腦中的氨基酸病態(tài)模式治療肝性腦病，但高F值寡肽對(duì)其他肝臟疾病的輔助治療作用可能與其他作用機(jī)制相關(guān)。研究［6］顯示，氧化應(yīng)激在肝臟損傷、癌癥、炎癥及衰老等多種病理生理變化方面扮演著重要角色。因此，物質(zhì)的抗氧化及清除自由基的作用與其生理功能存在密切關(guān)系，而活性肽的生理活性與其抗氧化性同樣存在密切的關(guān)系［7］。本試驗(yàn)將研究馬氏珠母貝高F值寡肽的體外抗氧化作用及其對(duì)H2O2誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

馬氏珠母貝高F值寡肽制品（PHFP）：根據(jù)文獻(xiàn)［8］制備，F(xiàn)值達(dá)到24.58，分子量分布在150～1 000Da；

DPPH（sigma）、脫氧核糖（Fluka）：北京華美生物技術(shù)有限公司；

L02正常肝細(xì)胞：上海細(xì)胞庫(kù)；

RPM I－1640培養(yǎng)基（GIBCO）、新鮮牛血清（杭州四季清）、雙抗（GIBCO）、0.25% 胰蛋白酶 （含 0.05%EDTA）（GIBCO）、MTT（Americo）、VC：廣州威佳生物技術(shù)有限公司；

15AA肝安注射液：廣東彼迪藥業(yè)有限公司；

其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試劑與儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV－2102，尤尼柯（上海）儀器有限公司；

CO2培養(yǎng)箱：RCO3000T－5－VBC，美國(guó)熱電集團(tuán)公司；

倒置顯微鏡：CKX41－A32P，日本Olympus公司；

低速臺(tái)式離心機(jī)：TDL－5－A，上海安亭科學(xué)儀器廠；

超低溫冰箱：ULT1386－3－V40，美國(guó)熱電集團(tuán)公司；

全波 段 酶 標(biāo) 儀：Bio－Tek HQuart，美 國(guó) Bio－Tek 儀 器公司；

超聲細(xì)胞處理器：FS－150，寧波新藍(lán)生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 清除·OH自由基的能力評(píng)價(jià)（TBA法） 根據(jù)文獻(xiàn)［9］，將PHFP樣品于4℃下保存，所有的樣品及緩沖液均采用微孔過(guò)濾膜過(guò)濾。將樣品溶液0.5mL加入0.7mL的反應(yīng)混合溶液中（20mmol/L的脫氧核糖0.5mL和10mmol/L的FeSO4－EDTA 0.2mL）混合溶液，采用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，20mmol/L）將反應(yīng)混合溶液稀釋到1.8mL，然后，再加入10mmol/L的H2O20.2mL。隨后，將此混合物于37℃下保存1h。最后，加入2.8%三氯醋酸（TCA）1mL終止反應(yīng)，再加入1.0% （m/m）硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0 mL，在100℃下煮沸15min，于532nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)s，空白（不加樣品溶液為空白）也于532nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)0。樣品對(duì)·OH自由基的清除率R1按式（1）計(jì)算：

方曉倩依然在高速路口等著他，他每次都說(shuō)別跑這么遠(yuǎn)來(lái)等，讓他不放心，她說(shuō):“時(shí)間那么少，多一秒是一秒?！彼悴桓以僬f(shuō)話(huà)。

1.3.2 清除DPPH·自由基能力評(píng)價(jià) 根據(jù)文獻(xiàn)［9］，將1.5mL DPPH·溶液（0.1mmol/L，溶于95% 乙醇）置于試管中，加入1.5mL待測(cè)液，振蕩混勻，室溫放置45min后，在517nm處測(cè)定其吸光值（Ai），空白為1.5mL 95% 的乙醇加入1.5mL蒸餾水調(diào)零，對(duì)照為1.5mL DPPH·溶液加上1.5mL蒸餾水在517nm處的吸光值（Ac），樣品在測(cè)定波長(zhǎng)的吸光值為Aj。樣品對(duì)DPPH·的清除率R2按式（2）計(jì)算：

1.3.3 清除O－2·自由基的能力評(píng)價(jià)（鄰苯三酚自氧化法） 根據(jù)文獻(xiàn)［9］，采用 Marklund法，向pH 8.2，2.8mL的Tris－HCl緩沖液（50mmol/L）中加入0.1mL待測(cè)樣品（空白為等量去離子水），于25℃ 保溫10min，然后加入0.1mL 25℃ 預(yù)溫的鄰苯三酚（60mmol/L）至總體積3.0mL（空白以等量10mmol/L的HCl代替），迅速搖勻，倒入1cm比色杯中，在420nm處，每隔半分鐘測(cè)定一次吸光值A(chǔ)值，線(xiàn)性時(shí)間為4min，根據(jù)鄰苯三酚自氧化速率計(jì)算抑制率（控制鄰苯三酚的自氧化速率為0.050～0.065OD/min）。樣品對(duì)O－2·的抑制率R3按式（3）計(jì)算：

式中：

ΔA420/ΔT（V0）—— 鄰苯三酚自氧化速率，OD/min；

ΔA420/ΔT（V）—— 添加抗氧化劑的樣液氧化速率，OD/min。

1.3.4 L02肝細(xì)胞培養(yǎng)及H2O2損傷模型的建立 將處于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肝細(xì)胞采用0.25%胰蛋白酶（含0.05%EDTA）消化后，RPMI－1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，將上述肝細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后，肝細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)，供試驗(yàn)用。以H2O2為原液，以含10%小牛血清的 RPM I－1640為培養(yǎng)液，稀釋配成含0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmo1/L 的 H2O21640培養(yǎng)液。吸出原培養(yǎng)液，將上述培養(yǎng)液加入96孔培養(yǎng)板中，以無(wú)H2O2的1640培養(yǎng)液為空白對(duì)照。每個(gè)濃度做4個(gè)平行孔，損傷培養(yǎng)12h后，以MTT法測(cè)肝細(xì)胞存活率，確定H2O2損傷濃度。當(dāng)H2O2損傷濃度確定后，同樣方法確定損傷培養(yǎng)時(shí)間，建立L02正常肝細(xì)胞的H2O2損傷模型。

1.3.5 高F值寡肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，將肝細(xì)胞懸液加入96孔和6孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后，肝細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)，供試驗(yàn)用。設(shè)a.對(duì)照組：培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，不加處理因素；b.H2O2模型組：培養(yǎng)液加入確定濃度的 H2O2；c.高F值寡肽預(yù)處理組：含濃度為500，1 000，1 500μg/mL PHFP的培養(yǎng)液預(yù)孵育8h后，加入確定濃度的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間。d.陽(yáng)性對(duì)照肝安組：含濃度為500μg/mL 15AA的培養(yǎng)液預(yù)孵育8h后，加入確定濃度的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間；e.陽(yáng)性對(duì)照維生素C組：含濃度為500μg/mL VC預(yù)孵育8h后，加入確定濃度的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間。每組至少設(shè)4個(gè)復(fù)孔。MTT比色法測(cè)定96孔板肝細(xì)胞的存活率。

MTT比色法：待測(cè)96孔培養(yǎng)板各孔加入20μL MTT試劑（5mg/mL，臨用前PBS溶解配制，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌），輕輕混勻，繼續(xù)37℃培養(yǎng)4h，然后向各孔加入100μL三聯(lián)液，繼續(xù)37℃保溫過(guò)夜，酶標(biāo)儀570nm比色。細(xì)胞存活率按式（4）計(jì)算：

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 細(xì)胞試驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均依X±S表示，組間均數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 高F值寡肽在化學(xué)反應(yīng)體系中清除自由基的活性

本試驗(yàn)利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH并攻擊α－脫氧核糖［10］，使其產(chǎn)生丙二醛后利用TBARS法進(jìn)行測(cè)定。如果反應(yīng)體系中存在自由基清除劑，即可減輕因受到·OH自由基的攻擊而發(fā)生α－脫氧核糖的氧化。圖1比較了酶解液、高F值寡肽、肝安及VC對(duì)·OH自由基的清除活性，4種樣品均表現(xiàn)具有一定的·OH自由基清除活性，并且隨著濃度的增加，清除能力也逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出劑量相關(guān)性，在樣品濃度＜5mg/mL范圍內(nèi)，劑量相關(guān)性較明顯，當(dāng)樣品濃度＞5mg/mL后，隨著濃度的增加，·OH自由基清除效果增加緩慢。并且，從圖1可看出，馬氏珠母貝高F值寡肽的清除效果最好，當(dāng)濃度達(dá)到10mg/mL時(shí)候，清除率達(dá)到了60.8%。

圖1 清除·OH自由基活性Figure 1 The scavenging abilities on·OH

DPPH·是一個(gè)大分子的穩(wěn)定自由基，被廣泛用于自由基清除劑的篩選［11］。圖2列出了酶解液、馬氏珠母貝高F值寡肽、肝安及VC對(duì)DPPH· 的清除活性，由圖2可知，4種樣品均表現(xiàn)出清除DPPH·活性，并且隨著濃度的增加，清除能力也逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出劑量相關(guān)性，在樣品濃度＜3mg/mL范圍內(nèi)，劑量相關(guān)性較明顯，而當(dāng)樣品濃度＞3mg/mL后，隨著濃度的增加，DPPH·清除效果增加趨勢(shì)較緩慢。并且，從圖2可以看出，陽(yáng)性對(duì)照VC清除DPPH·自由基的能力最強(qiáng)，在濃度為0.5mg/mL時(shí)，DPPH·自由基的清除能力就達(dá)到了71.3%。而馬氏珠母貝高F值寡肽清除DPPH·自由基能力與15AA相近，劑量關(guān)系曲線(xiàn)也較相似，在濃度為10mg/mL時(shí)，DPPH·自由基的清除能力達(dá)到了50.8%。

圖2 清除·DPPH自由基活性Figure 2 The scavenging abilities on·DPPH

O－2·的形成是氧毒性的主要因素，癌癥患者化療時(shí)，可誘發(fā)自由基O－2·的大量產(chǎn)生，引起骨髓損傷、白血球減少等嚴(yán)重的副作用［12］。圖3列出了酶解液、馬氏珠母貝高F值寡肽、肝安及VC對(duì)O－2·的清除活性。由圖3可知，VC清除O－2·自由基的能力最強(qiáng)，在濃度為3mg/mL時(shí)，O－2·自由基清除能力就已經(jīng)達(dá)到96.8%，而當(dāng)濃度＞3mg/mL時(shí)，VC對(duì)O－2·自由基的清除率達(dá)到100%。4種樣品中，高F值寡肽清除O－2·自由基的能力比15AA和酶解液高，并且隨著濃度的增大呈劑量相關(guān)性。

圖3 清除O－2·自由基活性Figure 3 The scavenging abilities on O－2·

綜合比較馬氏珠母貝高F值寡肽對(duì)不同自由基的清除能力可以發(fā)現(xiàn)，馬氏珠母貝高F值寡肽對(duì)自由基DPPH·、·OH和O－2·的清除效果完全不同，提示馬氏珠母貝高F值寡肽可能有著不同的抗氧化機(jī)制。3種自由基中，馬氏珠母貝高F值寡肽對(duì)·OH自由基的清除效果最好，·OH自由基是進(jìn)攻最強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)之一，一旦·OH自由基與物質(zhì)接觸，在接觸瞬間即可完成對(duì)物質(zhì)的攻擊。馬氏珠母貝高F值寡肽可能就是通過(guò)有效抑制了Fenton反應(yīng)后·OH的產(chǎn)生而達(dá)到抗氧化效果。并且，馬氏珠母貝高F值寡肽對(duì)3種自由基的清除效果均好于常用肝性腦病治療藥物肝安注射液，這為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更有效的治療肝臟疾病藥物提供了理論基礎(chǔ)。

2.2 高F值寡肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

2.2.1 H2O2損傷L02肝細(xì)胞模型的建立 為較好地顯示H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷與保護(hù)因子作用的差異，損傷后細(xì)胞存活率最好在30%～70%之間，并且為了更科學(xué)計(jì)算半數(shù)至死劑量LD50及試驗(yàn)的科學(xué)性，對(duì)H2O2損傷L02肝細(xì)胞建模。由圖4～5結(jié)果可看出，選擇H2O2的作用濃度為0.4，0.6，0.8mmol/L，作用時(shí)間為8h。

圖4 不同濃度H2O2損傷后L02肝細(xì)胞的存活率Figure 4 The L02cell viability after injury induced by H2O2

2.2.2 肝細(xì)胞損傷存活率的影響 表1顯示了馬氏珠母貝高F值寡肽對(duì)不同濃度H2O2誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。由表1結(jié)果可以看出：馬氏珠母貝高F值寡肽具有一定的抗H2O2損傷L02肝細(xì)胞的作用，在低劑量濃度時(shí)（500μg/mL），這種保護(hù)作用較不明顯，在中、高劑量濃度（1 000，1 500μg/mL）時(shí)，效果較好。在經(jīng)過(guò)馬氏珠母貝高F值寡肽保護(hù)處理后，H2O2對(duì)L02肝細(xì)胞的半數(shù)致死劑量LD50由原來(lái)的0.618mmol/L提高到0.737和0.734mmol/L，分別提高了19.3%和18.8%。而陽(yáng)性對(duì)照15AA和VC也均起到了一定的抗H2O2損傷L02肝細(xì)胞作用，半數(shù)致死劑量LD50分別提高到0.768和0.744mmol/L，提高了24.3%和20.4%。而酶解液處理后，LD50提高到0.688，也提高了11.3%，這可能是由于酶解液中含有一定量的牛磺酸，牛磺酸對(duì)肝細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用［13］。

圖5 L02肝細(xì)胞H2O2損傷時(shí)間的確定Figure 5 The effect of injured time on the L02cell viability

表1 馬氏珠母貝高F值寡肽對(duì)H2O2損傷L02肝細(xì)胞保護(hù)作用ńTable 1 The effect of PHFP on the L02 cells injury induced by H2O2

3 結(jié)論

在化學(xué)反應(yīng)體系中，馬氏珠母貝高F值寡肽對(duì)·OH、DPPH·及O－2·均具有一定的清除能力。在濃度為10mg/mL時(shí)，對(duì)3種自由基的清除率分別達(dá)到了60.8%、50.8%和44.2%。馬氏珠母貝高F值寡肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)作用，劑量為1mg/mL的馬氏珠母貝高F值寡肽使H2O2誘導(dǎo)損傷L02肝細(xì)胞的半數(shù)致死劑量LD50由損傷模型組的0.618提高到0.737，提高了19.3%。

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Preliminary study on the antioxidant activity and protective effects on L02 cell injury ofpinctada martensiihigh fischer ratio oligopeptides

ZHENG Hui－na1，2ZHANG Chao－h(huán)ua1，2JI Hong－wu1，2QIN Xiao－ming1，2

（1.Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang，Guangdong524088，China；2.College of Food Science＆ Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong524088，China）

The free radical scavenging activity of PHFP and the protective effects of PHFP on L02cells injury induced by H2O2were studied.The results indicated that in chemical reaction system，the scavenging ability of PHFP（10mg/mL）for three kind of free radical·OH、DPPH·and O－2·was 60.8%，50.8%and 44.2%respectively.And when the L02cells were treated with 1mg/mL PHFP，theLD50of H2O2changed from 0.618mmol/L to 0.737mmol/L，increased by 19.3%.

pinctada martensii；high fischer’ratio oligopeptides；antioxidant activity

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（編號(hào)：2007BAD29B09）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助（編號(hào)：貝類(lèi)，47）；廣東海洋大學(xué)引進(jìn)人才基金（編號(hào)：0912259）

鄭惠娜（1979－），女，廣東海洋大學(xué)講師，博士。E－mail：margaretphd＠126.com

章超樺

2010－08－01