沙棘生物活性肽的制備及功效研究

黃 鵬蘇 寧王昌濤

（1.北京工商大學(xué)植物資源研究開(kāi)發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100025；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

沙棘生物活性肽的制備及功效研究

黃 鵬1，3蘇 寧2王昌濤1

（1.北京工商大學(xué)植物資源研究開(kāi)發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100025；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

以沙棘粕為原料，制備生物活性肽；以多肽提取率為響應(yīng)值，通過(guò)正交試驗(yàn)，研究最佳的酶解工藝；并探討酶解液多肽粗提物的抗氧化及酪氨酸酶抑制率。結(jié)果表明：沙棘粕酶解制備多肽的最優(yōu)條件為加酶量3%、液料比15∶1（V∶m）、酶解反應(yīng)時(shí)間1h；5mg/mL粗提物對(duì)DPPH清除率為68%，酪氨酸酶抑制率為76%。

沙棘；酶解；正交試驗(yàn)；功效研究

沙棘果是一種含有多種生物活性物質(zhì)的藥用食物。前蘇聯(lián)學(xué)者發(fā)現(xiàn)其果實(shí)中含有黃酮和酚類(lèi)36種［1］。沙棘種子分離出來(lái)的蛋白質(zhì)有13種氨基酸，其中包括人體不能合成的8種必需氨基酸，尚含有大量的非蛋白氮［2］，氨基酸總量約占11%［3］。目前關(guān)于沙棘有效成分提取的研究開(kāi)發(fā)主要集中在黃酮類(lèi)物質(zhì)、沙棘油、花青素等方面，對(duì)沙棘蛋白提取報(bào)道相對(duì)較少，而且現(xiàn)有報(bào)道［4－5］多采用堿溶酸沉法提取，但該法容易造成蛋白質(zhì)變性失活。

本試驗(yàn)以沙棘粕為原料，采用蛋白酶法酶解制備植物生物活性肽，并對(duì)粗提液的抗氧化活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

沙棘粕：沙棘籽提油后的剩余物，青?？灯丈锛夹g(shù)股份有限公司提供；

Neutrase、Alcalase、Flavourzyme、Protamex蛋白酶：諾維信酶制劑公司；

NG蛋白酶：日本天野公司。

1.2 儀器與試劑

pH計(jì)：PHS－3D，上海三信儀表廠；

離心機(jī)：SIGMA 3－18K，美國(guó)Sigma公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－1，國(guó)華電器有限公司；

多用途水浴恒溫振蕩：DSHZ－300，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：T6新悅，北京普析通用儀器有限公司。

1.3 多肽粗提物的制備

稱取粉碎后的沙棘粕（經(jīng)50目過(guò)篩）10g，按一定液料比進(jìn)行混合，將樣品液置于水浴恒溫振蕩器預(yù)處理1h，加入一定比例的蛋白酶，再次將溶液置于水浴恒溫振蕩器預(yù)處理，反應(yīng)一定時(shí)間后，在80℃的恒溫水浴鍋中滅酶10min，然后在4 000r/min的條件下離心10min，提取上清液（測(cè)量多肽含量，計(jì)算多肽提取率）。將獲得的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至適當(dāng)體積后低溫冷凍干燥得多肽粗提物。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蛋白酶種類(lèi)的選擇 根據(jù)表1蛋白酶活力，加入相同活力的各種蛋白酶對(duì)沙棘粕進(jìn)行酶解，酶解條件為：加酶量3%、酶解溫度45℃，液料比10∶1（V∶m），按1.3制備酶解液，并測(cè)定各酶解液中多肽的含量。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，Neutrase酶對(duì)沙棘粕蛋白的酶解效果最佳。故本試驗(yàn)選擇Neutrase酶對(duì)沙棘粕蛋白進(jìn)行酶解。

表1 蛋白酶活力Table 1 Protease activity

1.4.2 酶解工藝條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定酶解條件為：加酶量3%、酶解溫度45℃，液料比10∶1（V∶m），然后分別變動(dòng)其中的某個(gè)參數(shù)：蛋白酶添加量分別為1%、3%、5%、7%、9%；液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（V∶m）；酶解時(shí)間分別為1，2，3，4，5h按1.3步驟進(jìn)行酶解試驗(yàn)，測(cè)定多肽的含量，并計(jì)算提取率。

1.4.3 正交試驗(yàn)方法 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最優(yōu)化酶解工藝條件參數(shù)。

1.4.4 功效研究 以沙棘活性多肽正交試驗(yàn)所獲得的最佳條件進(jìn)行提取，測(cè)定不同濃度多肽粗提物的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制率。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 多肽含量的測(cè)定 采用Folin－酚測(cè)定多肽含量。回歸方程：y＝0.002 7x＋0.041 5，R2＝0.996 9。y：吸光度值，x：蛋白質(zhì)含量（μg/mL）。

1.5.2 蛋白酶活力的測(cè)定 采用 QB/T1803——1993蛋白酶活力的測(cè)定方法。以酪蛋白為標(biāo)樣，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：y＝0.009 7x＋0.026 7，R2＝0.998 6。y：吸光度值，x：蛋白酶活力。

1.5.3 抗氧化活性測(cè)定 采用DPPH法［6］。在試管內(nèi)依次加入乙醇、DPPH、待測(cè)液，混勻，30min后在517nm處測(cè)吸光度，記為A；乙醇代替DPPH的測(cè)定值記為A1；蒸餾水代替待測(cè)品的測(cè)定值記為A0。DPPH自由基的清除率按式（1）計(jì)算：

式中：

K——對(duì)DPPH自由基的清除率，%；

A0——空白的吸光度值；

A——樣品的吸光度值；

A1——乙醇的吸光度值。

1.5.4 沙棘粕多肽提取率的計(jì)算 沙棘粕多肽提取率按式（2）計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝條件的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)立正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Table 2 The level of orthogonal factors

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3 The results and analysis of rthogonal test

由表3可知，3個(gè)因素對(duì)沙棘粕多肽提取率的影響大小依次為B＞C＞A，其最佳制備工藝組合為A2B3C1，即加酶量3%、液料比為15∶1（V∶m）、在45℃條件下反應(yīng)1h。按照該工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其多肽的平均提取率為4.48%，證明該工藝最優(yōu)。

2.2 功效研究

2.2.1 抗氧化活性測(cè)定 采用DPPH法測(cè)定不同濃度粗提物的抗氧化活性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，樣品濃度在1mg/mL到3mg/mL變化時(shí)，DPPH清除率隨著濃度的增加增幅較大，3mg/mL以后增幅較小。樣品濃度為5mg/mL時(shí)DPPH清除率為68%。由此可見(jiàn)，所制得的粗提物具有較好的抗氧化活性。

圖1 樣品濃度對(duì)DPPH清除率的影響Figure 1 Effect of sample concentration on clearance rate of DPPH

圖2 樣品濃度對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響Figure 2 Effect of Sample concentration on tyrosinase inhibition rate

2.2.2 酪氨酸酶抑制作用 樣品濃度對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著樣品濃度的增加，酪氨酸酶的抑制率也隨之增加。當(dāng)樣品濃度由2mg/mL到4mg/mL時(shí)，酪氨酸酶抑制率變化最明顯，之后抑制率趨于平緩。5mg/mL時(shí)抑制率達(dá)76%。

3 結(jié)論

酶解沙棘粕制備生物活性多肽的最優(yōu)提取條件為：加酶量3%，液料比15∶1（V∶m），酶解時(shí)間分別為1h。該條件下多肽提取率可達(dá)4.58%。沙棘活性多肽粗提取物有較高的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制率，具有較大的開(kāi)發(fā)前景。

1 張哲民.蘇聯(lián)沙棘油研究利用的進(jìn)展與對(duì)策［J］.沙棘，1990（3）：42～46.

2 葛孝炎，史國(guó)富，馬翠英.沙棘化學(xué)成分的研究概況［J］.中草藥，1986，17（8）：42～44.

3 金怡，姚敏.沙棘的研究概況［J］.中醫(yī)藥信息，2003，20（3）：21～22.

4 趙晨偉.沙棘分離蛋白提取工藝研究［J］.食品科技，2009，16（6）：33～35.

5 張文博，庫(kù)爾班江，張焱.新疆野生沙棘種仁蛋白的提取和氨基酸分析［J］.糧油加工，2008（8）：56～58.

6 Nikolaos Nenadis，Maria Tsimidou.Observations on the estimation of scavenging activity of phenolic compounds using rapid 1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl（DPPH·）tests［J］.JAOCS，2002，79（12）：1 191～1 195.

Study on preparation and efficacy of sea buckthorn polypeptide

HUANG Peng1，3SU Ning2WANG Chang－tao1

（1.Beijing Technology and Business University，Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，Beijing100048，China；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing100025，China；3.College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang150030，China）

Take sea buckthorn meal as raw material，and bioactive polypeptide is prepared.The degree of polypeptide content were used as response values .The optimum extracting condition was determined in process.Finally，anti－oxidation and tyrosinase inhibition rate were been discussed.The results show that the optimum conditions of preparation of bioactive polypeptide are enzyme concentration：3%，water feed ratio 15，time of 1h.Anti－oxidation and tyrosinase inhibition rates of 5mg/ml crude extracts were 68%and 76%.

sea buckthorn；protease；orthogonal experiment；efficacy

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

北京市科技新星項(xiàng)目（編號(hào)：2008B08）

黃鵬（1984－），男，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命技術(shù)學(xué)院在讀碩士研究生。E－mail：huangpeng0815＠sina.com

王昌濤

2010－07－11