飛機(jī)草活性物質(zhì)的提取及對(duì)有毒藍(lán)藻的增殖抑制

張 旭， 李洪武， 吳光明， 伴修平， 樸虎東

（1.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 ?？?570228；

2.海南斷山漁業(yè)有限公司，海南 三亞 572013；

3.滋賀縣立大學(xué) 環(huán)境科學(xué)部，日本 彥根 5228533；

4.信州大學(xué) 理學(xué)部，日本 松本 3908621）

飛機(jī)草活性物質(zhì)的提取及對(duì)有毒藍(lán)藻的增殖抑制

張 旭1， 李洪武1， 吳光明2， 伴修平3， 樸虎東4

（1.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 海口 570228；

2.海南斷山漁業(yè)有限公司，海南 三亞 572013；

3.滋賀縣立大學(xué) 環(huán)境科學(xué)部，日本 彥根 5228533；

4.信州大學(xué) 理學(xué)部，日本 松本 3908621）

飛機(jī)草（Eupatorium odoratumLinn.）活性物質(zhì)對(duì)有毒藍(lán)藻銅綠微囊藻（Microcystis ae?ruginosaKutzing.var.minor.H.W.Liang.，記作：NIES298）和魚害微囊藻（Microcystis ichthyob?labe Kutz.，記作：TAC95）具有增殖抑制作用.飛機(jī)草不同溶劑的浸提液對(duì)NIES298和TAC95的抑制效果：蒸餾水浸提比乙醇、丙酮抑制效果好.層析分離活性成分后，發(fā)現(xiàn)D3（Rf=0.524）的分離物對(duì)兩種藍(lán)藻的抑制作用非常明顯，74μg/g時(shí)即己表現(xiàn)出抑制作用，并且隨著飛機(jī)草浸提液使用劑量的加大，兩種藍(lán)藻的葉綠素a濃度明顯低于起始值.

飛機(jī)草；有毒藍(lán)藻；增殖抑制

飛機(jī)草（E.odoratum）又名香澤蘭，為菊科澤蘭屬，多年生草本或亞灌木植物[1]，是一種有毒、繁殖力強(qiáng)、增殖快、生態(tài)適應(yīng)性廣的惡性雜草[2-7]，不但可對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞，對(duì)農(nóng)、林、牧業(yè)生產(chǎn)也都造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.目前飛機(jī)草在我國的發(fā)生面積近3 000萬hm2，海南省是我國危害最重的省份之一[8].對(duì)于飛機(jī)草的防治與利用的研究一直在繼續(xù)，目前已經(jīng)形成了物理防治、化學(xué)防治、生物防治、綜合防治、檢疫制度等防治方法，由于飛機(jī)草的入侵特性，目前防治效果并不明顯[9-12].

本文將從開發(fā)利用的角度出發(fā)，探索飛機(jī)草的實(shí)用價(jià)值.

20世紀(jì)90年代以來，國內(nèi)水體富營養(yǎng)狀態(tài)日益嚴(yán)重，主要河流以及集合水湖均有嚴(yán)重的藍(lán)藻水華發(fā)生[13].有資料表明，我國已有66%以上的湖泊和水庫處于富營養(yǎng)化水平[14]，爆發(fā)藍(lán)藻水華的趨勢(shì)日漸明顯.藍(lán)藻水華一旦爆發(fā)，不但敗壞水質(zhì)，尤其影響水生生物的生長與生存[15-18].部分藍(lán)藻可產(chǎn)毒素[19]，能夠影響魚類的胚胎發(fā)育、增殖和行為，也可以引起肝臟和腎臟等內(nèi)部器官以及免疫系統(tǒng)的病變[20-26].哺乳動(dòng)物對(duì)此類毒素更加敏感[27]，可造成急性和慢性毒效應(yīng)[22，28-31]，對(duì)人體健康也構(gòu)成了嚴(yán)重的危害[24，32-33].

由于藍(lán)藻繁殖習(xí)性喜高溫、連續(xù)陰雨、悶熱、弱風(fēng)的氣候條件，較高的水溫是藍(lán)藻水華發(fā)生的重要條件之一[34]，海南省的氣候與環(huán)境條件非常利于藍(lán)藻水華的大面積爆發(fā).本文將依據(jù)飛機(jī)草具有的驅(qū)避、毒殺、影響生長發(fā)育以及作為傳統(tǒng)醫(yī)藥等多重功效[6，35-37]，探索飛機(jī)草是否具有抑制有毒水華藍(lán)藻增殖的作用.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試材與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)用試劑乙醇、丙酮、正丁醇、冰乙酸、MA培養(yǎng)基均為分析純.Bicine購于Sigma（St.Louis，MO，USA）.藍(lán)藻（NIES298和TAC95）來自日本滋賀縣立大學(xué).天然飛機(jī)草粉末（莖和葉）采摘后自然干燥，粉碎機(jī)粉碎.

儀器設(shè)備：冰箱（BCD-257SL，青島海爾股份有限公司）；pH儀（Delta 320，Mettler Toledo（上海）儀器有限公司）；可見分光光度計(jì)（722s，上海棱光技術(shù)有限公司）；磁力攪拌器（79-1磁力加熱攪拌器，江蘇金壇科達(dá)儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52CS，上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋（B-220，上海亞榮生化儀器廠）；滅菌鍋（YX280A，上海三申醫(yī)療器械有限公司）；濾紙（中速定性濾紙101，杭州新華紙業(yè)有限公司）；玻璃纖維濾膜GF/F（1825-025，Whatman International Maidstone England）；電子天平（BL-220H，Shimadzu Corporation Japan）；紫外燈（SLUV-6，日本ASONE株式會(huì)社）；無菌操作臺(tái)（SJ-DP，上海浦東物理光學(xué)儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（LSC-92，上海三申醫(yī)療器械有限公司）；純水儀（Molro 10a，上海摩勒生物技術(shù)有限公司）；薄層Chromatography展開槽（100-7L，日本矢澤科學(xué)）；層析紙（3030-909，England）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)藻的培養(yǎng)

培養(yǎng)基為MA培養(yǎng)基，pH 8.60±0.02，配方見表1.恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25±1℃，光照5 000 lx.

表1 MA培養(yǎng)基（Ichimura，1979）Tab.1MA Medium（Ichimura，1979）

1.2.2 飛機(jī)草浸提液的粗提

浸提溶液采用蒸餾水，在浸提過程中，由于飛機(jī)草粉末本身未經(jīng)過任何除菌處理，加之海南的天氣因素，導(dǎo)致用蒸餾水直接浸提經(jīng)常發(fā)臭發(fā)腐.經(jīng)研究確定加CaO抑制此現(xiàn)象，先行確定抑制作用的有無.

準(zhǔn)確稱取飛機(jī)草粉末20.0 g，CaO 3.0 g于500 mL燒杯中混勻，加蒸餾水200 mL浸沒攪勻，用錫紙封口于室溫下浸提24 h后，經(jīng)0.45 μm中速定性濾紙過濾，濾液備用.

1.2.3 活性抑制實(shí)驗(yàn)

于24支10 mL培養(yǎng)管中加入5 mLMA培養(yǎng)基，121℃滅菌，冷卻后接入對(duì)數(shù)期藻1 mL，按梯度100、200、400 μL接入飛機(jī)草浸提液，對(duì)照組無添加.各條件組均做3聯(lián)處理，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天搖勻一次.對(duì)起始藻葉綠素a濃度進(jìn)行測(cè)定、記錄.培養(yǎng)3 d后，使用GF/F濾膜、抽濾器過濾藻，取濾膜加入5 mL 90%丙酮溶液，密封放于4℃冰箱抽取葉綠素a.24 h后取出，室溫下靜置30 min后，進(jìn)行吸光度測(cè)定，根據(jù)葉綠素a濃度的計(jì)算公式Armon[39]記錄645、663 nm波段下的吸光值.

1.2.4 不同溶劑浸提飛機(jī)草

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[38]，多種有機(jī)溶液中乙醇和丙酮的飛機(jī)草浸提液效果最好，應(yīng)用潛力最大，為此我們將取之與蒸餾水的浸提液做比較.準(zhǔn)確稱取飛機(jī)草粉末20.0 g 4份，CaO 3.0 g 1份.4個(gè)500 mL燒杯洗凈吹干，稱重.1份飛機(jī)草、CaO、200 mL蒸餾水于500 mL燒杯中混勻，其他3份分別加于500 mL燒杯，各加蒸餾水、乙醇和丙酮200 mL浸沒攪勻，錫紙封口于室溫下浸提24 h后，經(jīng)0.45 μm中速定性濾紙過濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50℃揮干，稱重.根據(jù)揮干物的質(zhì)量以1 g/100 mL的比例加入相應(yīng)蒸餾水于室溫下溶解24 h后，4℃保存?zhèn)溆?

于30支10 mL培養(yǎng)管中加入5 mL MA培養(yǎng)基，121℃滅菌，冷卻后接入對(duì)數(shù)期藻1 mL，分別加入400 μL各浸提液，對(duì)照組無添加.各條件組均做3聯(lián).后續(xù)步驟同活性抑制部分相同.

1.2.5 活性物質(zhì)的分離（紙層析）

配制正丁醇∶冰乙酸∶蒸餾水=4∶1∶2（v/v/v）作為層析流動(dòng)相.于預(yù)層析缸中加入30 mL，層析紙剪成20 cm×5 cm大小，垂直放入層析紙，流動(dòng)相上移至據(jù)上邊緣1～2 cm處時(shí)預(yù)洗完畢，以鉛筆劃一淺線，用吹風(fēng)機(jī)吹干整張層析紙.據(jù)底邊1.5 cm處以鉛筆劃一淺線，據(jù)左邊緣1 cm處開始點(diǎn)樣，每點(diǎn)飛機(jī)草浸提液100 μL，共點(diǎn)4點(diǎn)，點(diǎn)與點(diǎn)之間間距1 cm.以毛細(xì)吸管吸取點(diǎn)樣，每次均以吹風(fēng)機(jī)吹干后再繼續(xù)，直至點(diǎn)完.于層析缸中加入30 mL流動(dòng)相，垂直加入層析紙進(jìn)行層析，流動(dòng)相上移至距預(yù)洗線1～2 cm處時(shí)取出，以鉛筆做標(biāo)記，吹干.黑暗下波長365 nm紫外燈拍照，將層析條帶圈出，由下至上依次標(biāo)注為D1、D2、D3、D4和D5.

1.2.6 活性物質(zhì)分離（紙層析）后的各活性成分的效果確定

于42支10 mL培養(yǎng)管中加入5 mL MA培養(yǎng)基，121℃滅菌，冷卻后接入對(duì)數(shù)期藻1 mL，將4個(gè)樣點(diǎn)的D1、D2、D3、D4和D5分別剪下，以4個(gè)為一組分別加入到培養(yǎng)管中，空白組無添加，對(duì)照組加入相應(yīng)量的空白層析條帶。對(duì)起始藻葉綠素a濃度進(jìn)行測(cè)定、記錄.3 d后使用GF/F濾膜、通過抽濾器過濾藻，取濾膜加入5 mL 90%丙酮溶液，密封放于4℃冰箱抽取葉綠素a.24 h后取出，室溫下靜置30 min后，進(jìn)行吸光度測(cè)定，記錄645、663 nm波段下的吸光值.

1.2.7 活性成分的劑量

大量層析飛機(jī)草粗提液.100 mL燒杯洗凈吹干，稱重，記錄.取20個(gè)D3放于該燒杯，加蒸餾水浸沒，室溫下溶解24 h后，過濾，濾液于50℃揮干，稱重，記錄.

2 結(jié)果與討論

2.1 活性抑制結(jié)果

培養(yǎng)3 d時(shí)可見飛機(jī)草浸提液對(duì)兩種藍(lán)藻具有明顯的增殖抑制作用，并且100 μL時(shí)已見抑制效果，隨浸提液用量的加大，兩種藍(lán)藻的葉綠素a濃度明顯低于起始值，如圖1.以小球藻（Chlorella py?renoidosaChick.）為例，在實(shí)驗(yàn)用劑量范圍內(nèi)的飛機(jī)草浸提液對(duì)小球藻的增殖無抑制作用，見圖2.

圖1 蒸餾水+CaO條件下的飛機(jī)草浸提液對(duì)兩種藍(lán)藻的抑制效果Fig.1 The inhibitory effect of E.odoratum extrated by distilled water and CaO on two cyanobacteria

圖2 蒸餾水+CaO條件下的飛機(jī)草浸提液對(duì)小球藻的增殖影響Fig.2 The inhibitory effect of E.odoratum extrated by distilled water and CaO on C.pyrenoidosa

起始組為實(shí)驗(yàn)時(shí)藻葉綠素a的濃度.100（3d）、200（3d）、400（3d）分別代表加入飛機(jī)草浸提液100 、200、400 μL的各組培養(yǎng)3 d時(shí)的葉綠素a的濃度.

2.2 不同溶劑浸提液的抑制效果對(duì)比

圖1已證實(shí)飛機(jī)草浸提液對(duì)2種藍(lán)藻具有增殖抑制作用，不同溶劑下浸提液的效果對(duì)比用量均是選用400 μL.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒸餾水和蒸餾水+CaO的浸提液對(duì)兩種藍(lán)藻均具有明顯的抑制作用，說明在蒸餾水中加CaO并不影響抑制效果；乙醇和丙酮的浸提液對(duì)NIES298沒有抑制作用，如圖3；對(duì)TAC95的抑制作用明顯沒有蒸餾水+CaO的效果好，如圖4.后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇用蒸餾水+CaO浸提的原因是為了避免飛機(jī)草自身所帶細(xì)菌對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的干擾.選擇用蒸餾水浸提也是我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)出于環(huán)保、安全、健康的理念.

圖3 不同溶劑的浸提液對(duì)溶劑NIES298的抑制效果對(duì)比Fig.3 The inhibitory effect of extracts ofdifferent solvents on NIES298

圖4 不同溶劑的浸提液對(duì)TAC95的抑制效果對(duì)比Fig.4 The inhibitory effect of extracts of different solvents on TAC95

圖5 波長365 nm下的光譜照片F(xiàn)ig.5The photo under 365 nm wavelength

1、2、3、4、5分別為D1、D2、D3、D4、D5.h為D3移動(dòng)的距離；H為移動(dòng)相移動(dòng)的距離.

2.4 活性物質(zhì)分離后各成分的抑制效果

以NIES298的抑制效果可見，D3、D4及D5均具抑制作用，但D3的增殖抑制效果最為明顯.另外，D3組的葉綠素a濃度明顯低于起始值，見圖6.

圖6 加入各層析條帶后NIES298的葉綠素a濃度變化Fig.6 The concentration change of NIES298's Chlo?rophyll-a after adding the chromatographic bands

2.3 活性物質(zhì)的分離（紙層析）結(jié)果

UV（紫外光365 nm）下可見飛機(jī)草浸提液的成分分離結(jié)果，按照?qǐng)D譜反映，分為5個(gè)部分：D1、D2、D3、D4和 D5，各Rf值（h/H）分別為 0.088，0.224，0.524，0.771，0.929（見圖5）.

根據(jù)D3對(duì)NIES298的明顯抑制作用，繼而也驗(yàn)證了其對(duì)TAC95的抑制作用，同樣可見D3組的葉綠素a濃度低于起始值，見圖7.

2.5 活性成分劑量的計(jì)算結(jié)果

稱重測(cè)定實(shí)驗(yàn)用D3所含的分離物平均質(zhì)量為0.45 mg，即每100 μL飛機(jī)草浸提液中D3分離物的質(zhì)量.根據(jù)使用配量：于含5 mL培養(yǎng)基、1 mL藻液的培養(yǎng)管中分別加入100、200、400 μL的飛機(jī)草浸提液，計(jì)算得出D3分離物的濃度分別為74、145、281 μg/g.圖1可見，74 μg/g時(shí)即對(duì)兩種藍(lán)藻具有增殖抑制作用，并且隨著飛機(jī)草浸提液使用劑量的加大，兩種藍(lán)藻的葉綠素a濃度均明顯低于起始值.

圖7 加入層析條帶D3后TAC95的葉綠素a濃度變化Fig.7The concentration change of TAC95's Chlorophyll-a after adding D3

3 結(jié)語

目前為止，已經(jīng)證明飛機(jī)草對(duì)有毒藍(lán)藻銅綠微囊藻和魚害微囊藻具有增殖抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)用蒸餾水做溶劑浸提的效果好于乙醇和丙酮，可實(shí)現(xiàn)環(huán)保、安全、健康的理念.不但如此，飛機(jī)草浸提液的使用還使得藍(lán)藻的葉綠素a濃度明顯低于起始值.另外，對(duì)于使用飛機(jī)草浸提液抑制藍(lán)藻增殖的過程中，是否會(huì)對(duì)自然環(huán)境中的有益藻產(chǎn)生不良影響，我們以小球藻（Chlorella pyrenoidosaChick.）為例，證明了對(duì)其增殖無抑制影響.層析結(jié)果已經(jīng)初步確定活性成分，計(jì)劃在后續(xù)研究中探究飛機(jī)草活性成分的高效提純法.另外，我們還計(jì)劃深度探究活性成分的物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)以及功效.

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Extraction of Eupatorium Odoratum and Its Inhibition on Toxic Cyanobacteria

ZHANG Xu1，LI Hongwu1，WU Guangming2，BAN Syuhei3，PARK Hodong4
（1.Ocean College,Hainan University，Haikou570228，China；
2.Duanshan Fishery LTD.,Sanya572013，China；
3.School of Environmental Sciences，University of Shiga Prefecture，Hikone5228533，Japan；
4.Faculty of Science,Shinshu University，Matsumoto3908621，Japan）

Eupatorium odoratumLinn.can inhibit the growth ofMicrocystis aeruginosaKutzing.var.minor.H.W.Li?ang.(NIES298)and Microcystis ichthyoblabe Kutz.(TAC95).The inhibitory effect of the extractions of E.odoratum from different solvents were compared and the result showed that E.odoratum extracted by water has better effect than that by ethanol and acetone.After chromatography we found D3（Rf=0.524）can restrain the two cyanobacteria clearly and the concentration of 74 μg/g had showed the effect.And as the dosage increased,the Chlorophyll-a’s concentrations of two cyanobacteria were significantly lower than the initial values.

E.odoratum；toxic cyanobacteria；inhibition

S 949

A

1674-4942（2010）04-0427-06

2010-09-11

與日本滋賀縣立大學(xué)橫向合作項(xiàng)目；海南大學(xué)“211工程”三期建設(shè)研究生科技創(chuàng)新平臺(tái)（創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室）支持項(xiàng)目

黃 瀾