腦梗死家兔模型內(nèi)皮損傷程度與梗死范圍的關(guān)系

杜學(xué)軍 李利斌 董群芳

內(nèi)皮損傷是腦梗死的重要病因之一［1］。然而，內(nèi)皮損傷程度與梗死范圍的關(guān)系國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，尤其是在經(jīng)保護(hù)內(nèi)皮藥物的干預(yù)下梗死范圍是否會(huì)有變化，國(guó)內(nèi)外均罕見報(bào)道。本研究在制備家兔腦梗死動(dòng)物模型基礎(chǔ)上進(jìn)行內(nèi)皮損傷的多指標(biāo)檢測(cè)，包括一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI-1)、血管性血友病因子抗原(vWF:Ag)，P-選擇素(GMP-140)，進(jìn)一步探討腦梗死發(fā)生、發(fā)展的病理生理機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物選擇、分組與處理 選取成年健康家兔24只(徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄各半，平均年齡4個(gè)月，平均體質(zhì)量(2.5±0.2)kg。隨機(jī)分為假手術(shù)組8只，梗死組8只，藥物干預(yù)組8只。各組動(dòng)物在年齡、體重、性別上無顯著差異。其中藥物干預(yù)組家兔在術(shù)前5 d經(jīng)胃灌入內(nèi)皮保護(hù)藥物通心絡(luò)0.5 g/(kg·d)(河北以嶺藥業(yè)公司提供)。所有動(dòng)物均術(shù)前肌內(nèi)注射慶大霉素8萬U預(yù)防性抗感染。氯氨酮，氯丙嗪各一支混合肌內(nèi)注射以全麻動(dòng)物。頭部備皮，碘伏消毒。

1.2 大腦中動(dòng)脈梗死模型制作:采用光化學(xué)誘導(dǎo)法(photochemical induced method)［2-3］。所有家兔在麻醉后沿顱骨的中央與眼后角垂直交叉處縱行切開皮膚約2 cm，暴露顱骨，刮離骨膜，在矢狀縫偏右(或偏左)0.5 cm與冠狀縫后0.5 cm用顱鉆鉆穿顱骨，造成圓形窗洞。假手術(shù)組到此結(jié)束，梗死組與藥物組動(dòng)物繼續(xù)進(jìn)行。延耳緣靜脈緩慢注入四氯四碘瑩光素二鈉(RB)(濃度35 g/L，總量1 ml/kg)。約3 min后用冷光源(波長(zhǎng)540 nm，功率140LX)對(duì)準(zhǔn)顱骨窗洞，連續(xù)照射8 min，縫合皮膚。24 h后，兩組動(dòng)物均出現(xiàn)意識(shí)障礙或偏癱或肌張力下降，均為動(dòng)物大腦中動(dòng)脈梗死模型制備成功。

1.3 標(biāo)本采集、處理與檢測(cè)方法 24 h后延耳緣靜脈抽取靜脈血約5～8 ml，注入含10%EDTA30ul和抑肽酶40ul的試管中。4℃條件下以3000 r/min離心15 min，取上清液放入-30℃冰箱中保存待測(cè)。NO采用硝酸還原酶法比色測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。ET，VWF:Ag，GMP-140，采用酶聯(lián)免疫吸付法(ELISA)測(cè)定，t-PA與PAI-1活性采用發(fā)光底物法，使用德國(guó)BE全自動(dòng)凝血儀。(試劑盒由上海太陽生物技術(shù)公司提供)，嚴(yán)格按說明操作。

1.4 相對(duì)腦梗死范圍測(cè)定(TTC法)48 h后將梗死組動(dòng)物斷頭取腦，去掉低位腦及腦干，冠狀切為0.5 cm的腦片。將腦片浸于2%2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中30 min后取出，再浸于10%甲醛液中固定一周。切取梗死組織，以其質(zhì)量占大腦質(zhì)量百分比為梗死范圍的相對(duì)指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在SPSS 13.0軟件上進(jìn)行。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。三組間比效采用方差分析，其中兩兩比較采用q檢驗(yàn)。兩組間比效采用t檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用pearson直線相關(guān)分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 各組家兔內(nèi)皮損傷指標(biāo)檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

梗死組動(dòng)物血中NO、t-PA活性明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)，而ET、PAI-1、vWF:Ag、GMP-140明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)。藥物組動(dòng)物的NO、t-PA活性明顯高于梗死組(P＜0.01)而 ET、PAI-1、vWF:Ag、GMP-140明顯低于梗死組(P ＜0.01)。

2.2 梗死組動(dòng)物的梗死范圍為14.80±6.22%，而藥物干預(yù)組動(dòng)物的梗死范圍為9.80±4.37%，差異顯著(t=7.25 P＜0.01)。

2.3 相關(guān)性分析 梗死組動(dòng)物血中NO和t-PA活性與梗死范圍呈負(fù)相關(guān)(r=-0.823 r=-0.768 P均＜0.01)，而ET、PAI-1活性、vWF:Ag和GMP-140與梗死范圍呈正相關(guān)(r=0.783，r=0.876，r=0.715，r=0.762，P 均 ＜0.01)。

3 討論

家兔的腦血管解剖結(jié)構(gòu)及組織類型接近于人類，是較好的研究腦梗死的動(dòng)物模型［4］。1985年waston率先利用光化學(xué)誘導(dǎo)法制成大鼠腦梗死模型。其原理是注射不能通過血腦屏障的光敏藥物，經(jīng)波長(zhǎng)560nm的光照后，產(chǎn)生并釋放屬于自由基的單鏈氧，使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的不飽和脂肪酸發(fā)生酯質(zhì)過氧化反應(yīng)，直接損害血管內(nèi)皮的完整性，使血小板粘付于血管內(nèi)皮，并發(fā)生釋放反應(yīng)，激發(fā)凝血過程，導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成［5］。此方法不僅手術(shù)創(chuàng)傷小，制備成功率高，而且能很好地模擬腦血管病理生理變化，有利于內(nèi)皮功能障礙的研究。

內(nèi)皮功能受損不僅表現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，更重要的是生物活性物質(zhì)分泌失衡。這些物質(zhì)的失衡不單純對(duì)血管收縮、舒張起作用，還產(chǎn)生局部炎癥，激活局部的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，使凝血活性增加，纖溶活性下降，并通過一系列細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制激活血小板上受體，使血小板進(jìn)一步遷移、粘附和產(chǎn)生釋放反應(yīng)［6］。新近研究提示，上述物質(zhì)失衡還可以抑制腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化，減少對(duì)缺血區(qū)的修復(fù)作用［7］。

ET與NO是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的兩種重要的生物活性物質(zhì)，在正常情況下，二者保持動(dòng)態(tài)平衡。ET是21個(gè)氨基酸殘基組成的生物多肽，是目前所知血管收縮作用最強(qiáng)最持久的生物肽，在腦血管發(fā)病中起重要作用［8］。NO是內(nèi)皮細(xì)胞合成的氣體生物活性物質(zhì)，其前體是L-精氨酸，具有強(qiáng)有力的擴(kuò)張血管作用，并抑制血小板的粘附與聚集［9，10］。已有研究表明腦梗死患者血ET水平增高，NO水平下降。本研究結(jié)論與之相同，但筆者發(fā)現(xiàn):ET水平與梗死范圍正相關(guān)(r=0.783 P＜0.01)，NO水平與梗死范圍負(fù)相關(guān)(r=-0.823 P＜0.01)，提示ET水平升高，NO水平下降，不僅是腦梗死的始動(dòng)因素，而且可能與血小板及凝血因子一起給參與了腦梗死的進(jìn)展過程。與梗死組動(dòng)物相比較，在內(nèi)皮保護(hù)藥物通心絡(luò)的干預(yù)下，藥物組動(dòng)物血中NO偏高且ET偏低，差異顯著(P＜0.01)，產(chǎn)生的結(jié)果是其梗死范圍明顯小于梗死組(P＜0.01)。也是這一論點(diǎn)的有力說明。

腦梗死時(shí)，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可以激活內(nèi)外源性凝血系統(tǒng)，使凝血功能顯著增強(qiáng)［11］。t-PA與PAI-1是纖溶系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，主要來自內(nèi)皮細(xì)胞分泌。t-PA是纖溶系統(tǒng)的主要啟動(dòng)因子，能選擇性激活血凝塊中的纖溶酶原，生成纖溶酶，水解纖維蛋白，溶解血栓纖維，還能抑制血小板聚集。PAI-1是t-PA的抑制物，可與t-PA形成1:1的復(fù)合物，滅活t-PA，對(duì)t-PA起調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，梗死組動(dòng)物的t-PA較假手術(shù)組顯著下降而PAI-1顯著升高(P＜0.01)，且t-PA與梗死范圍負(fù)相關(guān)(r=-0.768 P＜0.01)，PAI-1與梗死范圍正相關(guān)(r=0.876 P＜0.01)，說明:急性期腦梗死24 h內(nèi)，凝血功能增強(qiáng)的同時(shí)纖溶活性下降，血液處高凝狀態(tài)，可促進(jìn)血栓的進(jìn)一步進(jìn)展。內(nèi)皮保護(hù)藥物通心絡(luò)具有抗凝、提高纖溶活性的作用［12］，因此，與梗死組動(dòng)物相比，藥物組動(dòng)物t-PA活性增強(qiáng)而PAI-1活性下降，可阻止血栓進(jìn)展使梗死范圍縮小。

VWF是內(nèi)皮細(xì)胞合成的一種多聚體糖蛋白，在調(diào)節(jié)血小板粘附于受損的內(nèi)皮過程中起關(guān)鍵作用，內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)釋放入血增加，是反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)［13，14］。GMP-140是存在血小板a顆粒上的糖蛋白，正常血小板表達(dá)很少，血小板活化后隨a顆粒的釋放而增加。GMP-140在血小板表面高水平表達(dá)，是目前所知反映血小板活化和內(nèi)皮功能損傷最具特異性的分子標(biāo)志物［15］。Qqizilbash等發(fā)現(xiàn)VWF，GMP-140水平增高，是缺血性腦卒中發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［16］。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，梗死組動(dòng)物血中VWF:Ag，GMP-140水平顯著升高(P＜0.01)，且與梗死范圍正相關(guān)(r=0.715，r=0.762 P＜0.01)，表明:腦梗死后內(nèi)皮細(xì)胞損傷的同時(shí)，血小板活性增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞受損與血小板活性增加密切相關(guān)，二者共同促進(jìn)了腦梗死的進(jìn)展。從完整意義上講，內(nèi)皮保護(hù)藥物不僅要有保護(hù)血管內(nèi)皮形態(tài)、功能的作用，還要有抗血小板的作用。實(shí)驗(yàn)表明:通心絡(luò)在保護(hù)血管內(nèi)皮的同時(shí)抑制了 VWF:Ag、GMP-140的表達(dá)，從而使梗死范圍顯著縮小。

腦梗死的進(jìn)展是指在急性梗死發(fā)生后兩周內(nèi)神經(jīng)癥狀進(jìn)行性加重，至今原因不十分清楚［17］。筆者推測(cè)內(nèi)皮功能障礙在腦梗死進(jìn)展中起一定作用。內(nèi)皮損傷既有可能是腦梗死發(fā)生的原因，也有可能是腦梗死的結(jié)果，二者可能在一定范圍內(nèi)形成惡性循環(huán)。即:內(nèi)皮損傷-腦梗死-內(nèi)皮損傷加重-梗死進(jìn)展。筆者發(fā)現(xiàn)梗死組動(dòng)物內(nèi)皮損傷程度與梗死范圍有相關(guān)性，在內(nèi)皮保護(hù)藥物干預(yù)下，梗死范圍可以縮小，可能是這一過程的表現(xiàn)之一。具體的分子學(xué)機(jī)制目前尚不清楚，筆者推測(cè):急性梗死后，梗死區(qū)周圍血管內(nèi)皮損傷加重，ET水平升高而NO水平下降，動(dòng)脈血管強(qiáng)烈收縮;局部凝血功能增強(qiáng)而纖溶活性下降，纖維蛋白增多;活化的血小板在纖維蛋白上粘附、聚集;再加上神經(jīng)修復(fù)作用減弱以上共同作用使梗死范圍擴(kuò)大。因此，臨床上早期使用擴(kuò)血管藥、降纖藥及抗血小板藥可改善腦梗死患者的預(yù)后。

令人遺憾的是，同時(shí)具有上述作用且方便易行、不良反應(yīng)少的西藥太少了。眾多實(shí)驗(yàn)表明:祖國(guó)醫(yī)藥通心絡(luò)在保護(hù)心腦血管內(nèi)皮方面有積極作用［18］。本研究再次證實(shí):通心絡(luò)在保護(hù)腦血管內(nèi)皮的同時(shí)可顯著縮小腦梗死動(dòng)物的梗死范圍。

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