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    化濁通脈散對ASO家兔VEGF表達及血脂變化影響的研究*

    2010-11-29 00:48:36李慎賢
    天津中醫(yī)藥 2010年6期
    關(guān)鍵詞:通脈免疫組化批號

    李慎賢

    (中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科,沈陽 110004)

    下肢動脈硬化閉塞癥(ASO),動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病率居高不下。血清低密度脂蛋白的升高,對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生嚴重損傷,因此降脂治療可減少動脈血管內(nèi)皮損害,抑制AS的進展,從而消除ASO的發(fā)病基礎(chǔ)[1-2]。本實驗通過高脂飲食喂養(yǎng)家兔及股動脈血管內(nèi)膜造成機械性損傷,模擬ASO形成過程以化濁通脈散干預(yù),檢測實驗前后家兔的血脂變化及觀察局部血管斑塊血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達,探討該方治療ASO的機制,為明確中藥作用靶點及新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 實驗材料 新西蘭大耳白兔40只,4月齡,體質(zhì)量2.5~2.8 kg,由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供,許可證號:SCXK(遼)2003-0013?;瘽嵬}散組成:黃芪50 g,赤芍20 g,川芎20 g,當歸20 g,地龍 20 g,紅花 10 g,川牛膝 10 g,水蛭 10 g,澤瀉10 g,焦山楂20 g,由三九藥業(yè)集團提供,批號:0807021。阿司匹林:由沈陽奧華制藥有限公司生產(chǎn),批號:080606。膽固醇:由國藥集團化學試劑沈陽有限公司提供,批號:F20071220。牛血清白蛋白注射液:由北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司生產(chǎn),批號:20080815。

    1.1.1 實驗試劑與儀器 免疫組化試劑盒:VEGF、生物素化羊抗兔IgG、鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)由武漢博士德生物工程有限公司提供,批號:20090214。主要儀器:德國eppendorf 5417R離心機,雅培ARCHITECT ci8200全自動生化免疫分析儀,Olympus Bx-41型光學顯微鏡,德國Ldilacom-1900型石蠟切片機。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 造模與分組 實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,排除飲食異常者。1周后隨機分為4組,每組10只:即化濁通脈散組(A),阿司匹林組(B),模型組(C),假手術(shù)組(D),分籠飼養(yǎng)。D組喂養(yǎng)普通飼料,自由飲水,其余3組自實驗開始喂高脂飲食(正常飼料中加膽固醇1 g,豬油5 g),共喂養(yǎng)12周。其中實驗開始第3天對全部家兔以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔麻醉,行左側(cè)股動脈插管,在大腿近端沿左股動脈走行處,鈍性分離出股動脈約2 cm,動脈壁上剪一小口后插入球囊至大腿近端處,球囊反復牽拉8次,以確保內(nèi)膜損傷,退出導管,慶大霉素稀釋液沖洗傷口。逐層縫合皮下組織和皮膚。術(shù)后肌肉注射慶大霉素8萬U 1次預(yù)防感染。手術(shù)后第4天A、B、C組靜脈注射牛血清白蛋白250 mg/kg;D組注射等量的生理鹽水。第13周各組均為普通飼料喂養(yǎng),且A組予化濁通脈散7.2 g/(kg·d)混入飼料(藥物均根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算[3]),B組給予腸溶阿司匹林12.6 mg/(kg·d)混入飼料中,C、D兩組均未加任何藥物,在以上條件下共喂養(yǎng)3周。

    1.2.2 各實驗指標測定及方法 造模前與實驗結(jié)束時分別取兔耳緣靜脈取外周靜脈血2 mL,均以2500 r/min離心30 min,取得血清,應(yīng)用雅培全自動生化免疫分析儀分別檢測甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等,比較各組數(shù)值造模前后的變化及各組之間的變化。

    1.2.3 取材及局部血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)免疫組化 實驗結(jié)束取血后,應(yīng)用麻醉法處死全部動物,切取左髂股動脈2~3 cm,留取1~2 cm縱行切開,肉眼觀察血管內(nèi)膜斑塊形態(tài)。利用免疫組化法觀察:1)用多聚賴氨酸(Poly-Lysine)少許涂載玻片待涼干備用。2)切片常規(guī)脫蠟至水。3)3%雙氧水(H2O2)室溫孵育8min,蒸餾水洗3次。4)將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液,微波爐加熱至沸騰后斷電,間隔10 min后,反復2次;冷卻后磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS),pH 7.2~7.6洗滌2次。5)滴加5%正常山羊血清(BSA)封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,不洗。6)滴加適當稀釋的一抗1∶150兔抗VEGF,4℃過夜,PBS洗5 min×3次。7)滴加二抗:生物素化山羊抗兔IgG,37 ℃ 20 min。PBS洗 2 min,3次。8)滴加試劑SABC,37℃20min。PBS洗5min×4次。9)取1mL蒸餾水,加試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻后加至切片,鏡下控制反應(yīng)時間,一般在5~30 min之間,蒸餾水洗滌終止反應(yīng)時間。10)脫水,中性樹膠封片,備光鏡下觀察。

    1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,正態(tài)分布資料采用單因素方差分析,偏態(tài)分布資料采用秩和檢驗,P<0.05表示有差異,P<0.01表示有顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 股動脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)特點 肉眼可見,股動拖拉處管壁明顯增厚,有較大的斑塊形成,管腔狹窄。光鏡下可以看到,斑塊中有大量泡沫細胞堆積,一些血管內(nèi)皮細胞長入斑塊周圍,伴有平滑肌細胞和膠原組織增生。

    2.2 免疫組化結(jié)果正常兔血管壁無VEGF表達[4],結(jié)果顯示:A組(圖1A)與C組(圖1C)相比:斑塊區(qū)表達的陽性率明顯降低(P<0.01),B 組與 C 組,斑塊區(qū)陽性率無明顯差異(P>0.05),A 組(圖 1A)與 D 組(圖 1D)相比,表達的陽性率略有升高(P<0.01),因此,A組的表達陽性率明顯低于B組及C組,見表1。

    表1 髂股動脈血管內(nèi)皮生長因子表達的免疫組化分析(±sTab.1 Immunohistochemistry analysis of the expression of VEGF in the arteria iliacofemoralis(±s%

    表1 髂股動脈血管內(nèi)皮生長因子表達的免疫組化分析(±sTab.1 Immunohistochemistry analysis of the expression of VEGF in the arteria iliacofemoralis(±s%

    n組別A組B組C組D組10101010 VEGF陽性率33.165±1.01750.321±1.28150.209±2.07724.936±1.735

    2.3 血脂系列檢查結(jié)果造模前各組血脂指標比較無顯著差異(P>0.05)。實驗結(jié)束后,A 組與 B 組、C組相比較:TC、TG、LDL-C 均較低(P<0.01),有顯著性差異,而 HDL-C(P>0.05),無顯著性差異。B 組與C 組相比較:TC、TG、HDL-C 無顯著性差異 (P>0.05),但 LDL-C 低于 C 組(P<0.01)。A 組與 D 組相比,通脈化濁散組TC、TG、LDL-C明顯低于D組(P<0.01),而 HDL-C(P>0.05)未見明顯差異。見表2

    3 討論

    有研究認為降脂療法可以有效的治療AS,實驗結(jié)果表明本方能明顯降低TC、TG、LDL-C等指標,尤以降LDL-C最為突出。提示本方具有調(diào)節(jié)血脂、改善血脂代謝的作用,可能是通過降低TC、LDL-C來抑制VLDL-C的氧化修飾,減少炎癥因子導致的血管損傷,因此,有利于發(fā)揮穩(wěn)定粥樣斑塊的效果。

    另外,本實驗通過使用化濁通脈散對模型家兔動脈硬化斑塊VEGF進行干預(yù),實驗數(shù)據(jù)證實化濁通脈散組與模型組相比,斑塊染色呈弱陽性表達,模型組、阿司匹林組與化濁通脈散組相比斑塊染色均呈強陽性表達,化濁通脈散組的VEGF染色陽性面積明顯減少,提示本方可減少斑塊血管新生的作用,且與減少VEGF表達有關(guān),所以化濁通脈散可有抑制斑塊內(nèi)血管新生,抑制斑塊生長等作用。因此,化濁通脈散可針對ASO病理基礎(chǔ)展開治療,抑制VEGF表達,降低血脂減少內(nèi)皮細胞損傷,因而具有治療ASO的作用。

    表2 各組動物血脂指標比較(±sTab.2 Comparison of blood lipid indexes in

    表2 各組動物血脂指標比較(±sTab.2 Comparison of blood lipid indexes in

    注:A組與B組、C組,有顯著性差異,*P<0.01;A組與B組、C組,有顯著性差異,△P<0.01;A 組與 D 組,有顯著性差異,●P<0.01。

    mmol/L組別A組various groups(±sB組C組D組治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后TC 1.96±0.7316.02±2.23*△#1.98±0.7019.98±1.242.00±0.1621.19±1.391.99±0.957.71±1.52*TG 1.58±0.607.52±1.17*△#1.55±0.7310.40±0.651.56±0.5110.71±0.651.55±0.533.72±1.26*HDL 0.62±0.510.63±0.290.63±0.100.62±0.110.61±0.640.61±0.310.60±0.480.64±0.34 LDL 0.61±0.506.21±1.09*△#0.61±0.187.70±0.61△0.61±0.6711.47±0.890.59±0.511.03±0.33*

    傳統(tǒng)中醫(yī)認為ASO屬中醫(yī)“脈痹”、“脫疽”、“血癖”等范疇,其形成機制與寒凝血瘀相關(guān),治療多以溫經(jīng)散寒,活血通脈為主,代表方劑如:陽和湯、四妙勇安湯,實際應(yīng)用體會療效并不十分理想?,F(xiàn)代中醫(yī)認為本病多因飲食失節(jié),多食膏粱厚味,而損傷脾胃,造成臟腑虧虛、濕濁內(nèi)生,導致痰瘀互結(jié)阻塞經(jīng)脈。因此,遵循“治病務(wù)求其本”的原則本方遵循此病機采用“行氣活血、化痰通脈”的治療原則配置而成。本方重用黃芪益氣,推動氣血運行,并激發(fā)臟腑功能活動,以助痰濕運化;當歸重在養(yǎng)血活血祛瘀通脈;兩藥合用可宣通氣血共為君藥。地龍、水蛭、紅花、赤芍活血散瘀通經(jīng),現(xiàn)代醫(yī)學研究具有抗凝作用,防止血栓形成;澤瀉、焦山楂泄?jié)窕瘽?,有降血脂作用,兩組共為臣藥。牛膝引藥下行直通下肢,兼以活血,為佐使藥;全方共湊益氣活血、化濁通脈之功效。上述實驗也以證明本方對ASO形成的不同環(huán)節(jié)起到了干預(yù)作用[5]。

    [1]Danlel Steinberg.Atherogenesis in perspective:Hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime[J].NatMed,2002,8(11):249-259.

    [2]Haug C,Lenz C,Diaz F.Oxidized low-density lipoproteins stimulate Extrace llular matrixmetalloproteinase inducer(EMMPRIN)release by coronary smooth muscle cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24:1823-1829.

    [3]徐淑云,卞如濂,陳 修.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版,2002:202-203.

    [4]InoueM,ItohH,Ueda M,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)expressin in human coronary atherosclerosis lesions possible pathophysiologicalsignificance of VEGF in progression of atherosclerosis[J].Circulation,1998,98(20):108-116.

    [5]李慎賢,胡 瑩.化濁通脈散加疏血通治療早期動脈硬化閉塞癥 80 例療效觀察[J].2005;28(3):39-41.

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