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    復(fù)方益腎膠囊對大鼠糖尿病腎病的藥效學(xué)研究*

    2010-11-29 00:48:40宮凌濤李桂霞曹永剛陳淑欣王亞賢
    天津中醫(yī)藥 2010年6期
    關(guān)鍵詞:血糖糖尿病

    宮凌濤 ,李桂霞 ,曹永剛 ,陳淑欣 ,王亞賢

    (哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥理教研室,大慶 163319;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)中藥教研室,大慶 163319)

    糖尿病腎病(DN)是糖尿?。―M)的主要并發(fā)癥和致死原因之一,占DM慢性并發(fā)癥住院患者的33.6%[1],基本病變?yōu)槟I小球基底膜(GBM)增厚和系膜基質(zhì)增生。其特征性病變是結(jié)節(jié)性腎小球硬化,也可表現(xiàn)為彌漫性腎小球硬化癥及腎小球滲出性損害[2]。DN的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,目前尚未完全闡明。DN一旦形成治療是困難的,預(yù)防是重點(diǎn),中醫(yī)藥對糖尿病腎病的治療有獨(dú)特的優(yōu)勢和治療特色。因此筆者采用中醫(yī)辨證理論,配以中藥土鱉蟲為主藥組成的復(fù)方益腎膠囊。通過對大鼠腎小球基底膜的組織學(xué)觀察和腎功能檢查,發(fā)現(xiàn)該藥對治療糖尿病腎病有確切療效。

    1 材料和方法

    1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠70只,清潔級,體質(zhì)量180~220 g,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,尿檢陰性,健康狀況良好。

    1.2 實(shí)驗(yàn)器材 大鼠血壓測定儀(日本,KN-210);血糖測定儀(日本京都1810);Leica RM 2135病理切片機(jī)、Leica EG1160病理包埋機(jī)、Leica DM 4000B-DFC 300 FX數(shù)據(jù)成像系統(tǒng)(德國Leica公司產(chǎn)品)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及藥物 鏈尿佐菌素(STZ,Sigma公司提供)。馬來酸依那普利,石家莊藥業(yè)集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司,批號:國藥準(zhǔn)字H20055813,生產(chǎn)批號:0808201,規(guī)格:5 mg/片。復(fù)方益腎膠囊由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)中藥制劑室提供。

    1.4 藥物配制土鱉蟲水提物 土鱉蟲水浸12 h,勻漿后于65℃恒溫水浴4 h,過濾定容成2 kg/L。土鱉蟲脂取物:土鱉蟲正丁醇萃取液濃縮成2 kg/L。復(fù)方益腎膠囊:附桂地黃丸組成加枸杞、益母草制成顆粒后與土鱉蟲實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果結(jié)合裝入膠囊備用,0.40 mL/膠囊(含生藥 0.70 g)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 動物模型的建立[3-4]選擇Wistar雄性大鼠70只,180~220 g。隨機(jī)選10只設(shè)為空白對照組,普通喂養(yǎng)。余60只喂以高脂飼料(基礎(chǔ)飼料加蔗糖、煉豬油、膽固醇等混合而成,比例為 6∶5∶25∶1),1 周后將STZ1.5 g溶于0.1 mol/L配制的檸檬酸三鈉—檸檬酸緩沖液(pH值為 4.5)300 mL中,含檸檬酸三鈉882 mg,含檸檬酸630 mg,給大鼠STZ25 mg/kg腹腔注射,連續(xù)4周,繼續(xù)喂以高脂飼料,同時給予青霉素預(yù)防感染。4周后尾靜脈采血測定空腹血糖(禁食8h)及糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)2 h后血糖(根據(jù)OGTT成人75 g/次的國際標(biāo)準(zhǔn)以大鼠體表系數(shù)換算),空腹血糖≥13.8 mmol/L或OGTT2 h后血糖≥16.7 mmol/L大鼠造模成功,造模時間共5周。

    2.2 分組 挑選造模成功50只糖尿病腎病大鼠,隨機(jī)分成糖尿病模型組、土鱉蟲水提物組、土鱉蟲脂取物、復(fù)方益腎膠囊組、陽性藥物對照組(依那普利治療組),10只/組,與空白對照組,共6組。

    2.3 各組藥物 均以混懸液灌胃。陽性藥物(依那普利)對照組、土鱉蟲水提物組、土鱉蟲脂取物、復(fù)方益腎膠囊組每次分別 0.2 mg/只、2.5 mL/只、2.0 mL/只、2膠囊/只,2次/d灌胃;空白對照組和糖尿病模型組灌胃等量生理鹽水;各組每日灌胃2次,連續(xù)6周。

    2.4 觀測指標(biāo) 尿微量白蛋白(MALB);血肌酐和尿素氮;腎臟組織病理檢查。

    2.5 標(biāo)本采集與檢測 12周末測大鼠體質(zhì)量、飲水量,置大鼠于代謝籠中收集24 h尿液,測其總量,取出1~3 mL備用,采用比色法測定尿蛋白含量,換算24 h尿蛋白量。大鼠禁食不禁水12 h,各組隨機(jī)選8只經(jīng)5%戊巴比妥鈉麻醉后,心臟取血,測定大鼠空腹血糖,血肌酐和尿素氮。剖腹取出左腎、自腎門處切成兩片,10%中性甲醛固定,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋,連續(xù)4 μm切片,固定于載玻片上,進(jìn)行PAS染色,光鏡病理檢測。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS軟件分析系統(tǒng)處理結(jié)果,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間采用單因素方差分析。

    3 結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)過程中,復(fù)方益腎膠囊組10只、糖尿病模型組10只(2只死亡),糖尿病模型組表現(xiàn)出典型的多食、多飲、多尿、明顯消瘦,皮毛無光澤。

    3.1 糖尿病腎病腎小球的病理改變 腎臟外觀可見各造模組大鼠腎臟體積增大,皮質(zhì)增厚而蒼白,腎乳頭壞死、脫落。PAS染色顯示腎小球肥大,腎小球基底膜和腎小管基底膜增厚。腎小球系膜基質(zhì)增多;腎小球出現(xiàn)無細(xì)胞性結(jié)節(jié)狀硬化(K-W結(jié)節(jié)形成)。腎小球毛細(xì)血管袢的纖維素樣或類脂樣帽狀病變。腎小球毛細(xì)血管微血管瘤形成;腎小球入球小動脈和出球小動脈玻璃樣變。提示糖尿病腎病模型制備成功。復(fù)方益腎膠囊組對上述病變均有改善。見圖1。

    3.2 對大鼠空腹血糖、體質(zhì)量、腎功能、24 h尿蛋白定量的影響

    3.2.1 復(fù)方益腎膠囊對大鼠空腹血糖、體質(zhì)量的影響 見表1。

    表1 復(fù)方益腎膠囊對大鼠空腹血糖、體質(zhì)量的影響(±s)Tab.1 Effect of compound tonifying kidney capsule on blood-fasting sugar and body weight in rats(±s)

    表1 復(fù)方益腎膠囊對大鼠空腹血糖、體質(zhì)量的影響(±s)Tab.1 Effect of compound tonifying kidney capsule on blood-fasting sugar and body weight in rats(±s)

    注:與空白組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與糖尿病模型組比較,*P<0.05 ,**P<0.01;與陽性對照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

    組別空白對照組糖尿病模型組土鱉蟲水提物組土鱉蟲醇取物組復(fù)方益腎膠囊組陽性藥物對照組n 108991010體質(zhì)量(g)334±5.1180±4.8△△212±5.2△△*▲258±5.6△△**282±4.9△**▲268±5.3△△**空腹血糖(mmol/L)5.67±0.3421.32±2.42△△19.76±2.52△△*▲16.23±2.23△△**▲▲13.46±1.87△△**▲▲20.68±2.31△△

    由表1可見,糖尿病腎病模型組大鼠空腹血糖持續(xù)升高,日飲水量增多,尿量增多,體質(zhì)量減少,與空白對照組比較均有非常顯著性差異(P<0.01);土鱉蟲脂取物組、復(fù)方益腎膠囊治療組的大鼠空腹血糖明顯降低,與糖尿病模型組、陽性藥物對照組比較差異顯著(P<0.01);土鱉蟲水提物組也有一定程度降低血糖(P<0.05);陽性藥物依那普利無明顯降血糖作用。

    3.2.2 復(fù)方益腎膠囊對大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量的影響 見表2。

    由表2可見,糖尿病腎病模型組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮明顯增加,與空白對照組比較有顯著差異(P<0.01),復(fù)方益腎膠囊治療組24 h尿蛋白、血肌酐明顯下降,與糖尿病模型組比較均有非常顯著性差異(P<0.01);土鱉蟲脂取物組對腎功能(24 h尿蛋白、血肌酐)有一定程度改善(P<0.05),土鱉蟲水提物組對腎功能無改善;復(fù)方益腎膠囊組和陽性藥物對照組對尿素氮有降低(P<0.05),但其他治療組不明顯。說明提示復(fù)方益腎膠囊在減少尿蛋白、血肌酐、尿素氮方面優(yōu)于土鱉蟲水提物組和土鱉蟲脂取物組,而與陽性藥物對照組相近。

    表2 復(fù)方益腎膠囊對大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量的影響(±sTab.2 Effect of compound tonifying kidney capsule on the function of the kidney and protein quality for 24 h(±s

    表2 復(fù)方益腎膠囊對大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量的影響(±sTab.2 Effect of compound tonifying kidney capsule on the function of the kidney and protein quality for 24 h(±s

    注:與空白組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與糖尿病模型組比較,*P<0.05 ,**P<0.01;與陽性對照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01 。

    組別空白對照組糖尿病模型組土鱉蟲水提物組土鱉蟲醇取物組復(fù)方益腎膠囊組陽性藥物對照組10 n 1089910血肌酐(μmol/L)45.20±3.1567.46±4.18△△62.48±3.79△△▲▲54.62±3.18△△*▲51.58±1.39△△**51.27±3.25△△**尿素氮(mmol/L)6.67±1.3419.89±2.56△△19.28±2.26△△▲19.81±2.48△△▲18.67±2.38△△*18.58±2.53△△*尿蛋白(mg/24 h)7.58±3.1227.23±3.47△△23.58±3.56△△*▲▲20.46±3.43△△**▲16.56±3.58△△**16.83±3.28△△**

    4 討論

    尿蛋白是各種腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎病的危險因素,DN是引起慢性進(jìn)展性腎病最重要的原因[5]。尿蛋白的增多與糖尿病腎病的進(jìn)程密切相關(guān),DN的基本病機(jī)為氣虛血瘀,并且貫穿于疾病的全病程,其機(jī)制主要與腎小球上皮細(xì)胞受損和數(shù)量的減少有關(guān)[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,2型糖尿病主要以氣陰兩虛為主,在治療方法多以益氣、滋陰的藥物為主,而忽略了對其并發(fā)癥的治療,本課題研究主要針對其并發(fā)癥腎病的實(shí)驗(yàn)研究,根據(jù)中醫(yī)絡(luò)脈理論和絡(luò)病學(xué)說中“久病入絡(luò)”、“久病入血”、“久病入腎”及“病入絡(luò)為瘀”的觀點(diǎn),現(xiàn)代研究所證實(shí)糖尿病血管病變存在瘀血阻絡(luò)的病理改變的特點(diǎn),以及中醫(yī)的“久病傷陰,陰損及陽”的特點(diǎn)[7],筆者認(rèn)為腎絡(luò)瘀阻,陰陽兩虛是DN微血管病變的病機(jī)。因此筆者根據(jù)中醫(yī)方劑藥物配伍理論,以張仲景名方金匱腎氣丸為基本組成,加以活血化瘀藥組成復(fù)方益腎膠囊,主要功效為化瘀散結(jié),益氣扶正。王怡等[8]利用多種方法測定了5種蟲類藥對血液流變性的影響,結(jié)果顯示土鱉蟲對血液流變性各參數(shù)的改善作用最強(qiáng);同時土鱉蟲還可降低血脂。以活血化瘀藥土鱉蟲為君藥,以山茱萸、桂枝、熟地黃、枸杞等養(yǎng)陰助陽中藥為輔藥,從整體上來治療DN微血管病變。

    研究結(jié)果表明,DN動物模型的血糖持續(xù)升高,日飲水量增多為正常鼠的8~9倍;尿量增多約為正常鼠的10~11倍,體質(zhì)量減少,符合糖尿病的“三多一少”特型特征;同時尿白蛋白顯著增多,表現(xiàn)為糖尿病腎損傷的癥狀。各造模組大鼠血尿素氮升高,病理檢測呈現(xiàn)彌漫性糖尿病腎小球硬化癥和結(jié)節(jié)性糖尿病腎小球硬化癥。復(fù)方益腎膠囊治療后模型大鼠空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐明顯下降,飲水量和尿量顯著減少,體質(zhì)量增加,依那普利治療組飲水量和尿蛋白顯著減少,血糖和尿量沒有明顯變化;復(fù)方益腎膠囊和依那普利對降低DN模型大鼠升高的血尿素氮有一定作用。提示復(fù)方益腎膠囊有降低血糖、減少尿蛋白、血肌酐、尿素氮、減少DN大鼠飲水量和尿量的作用。

    [1]中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會慢性并發(fā)癥調(diào)查組.1991-2000年全國住院糖尿病患者慢性并發(fā)癥及相關(guān)大血管病變回顧性分析[J].中華醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2002,24(5):447-451.

    [2]黎磊石.進(jìn)一步重視糖尿病的防治研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1999,7(9):327-328.

    [3]周迎生,高 巖,李 斌,等.高脂喂養(yǎng)聯(lián)合聯(lián)合鏈尿佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào),2005,13(3):154-158.

    [4]馬淑珍,杜 鵑,馬俐儒.鏈尿佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠血尿滲透壓的變化極其意義[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2008,8(12):977-978.

    [5]張麗芬,趙進(jìn)喜,呂仁和,等.糖尿病腎病腎功能不全防治優(yōu)化方案的有效性和安全性研究[J].中醫(yī)雜志,2006,47(10):755-756.

    [6]陳濟(jì)德,司延林.糖腎復(fù)原湯對大鼠早期糖尿病腎臟損害療效的實(shí)驗(yàn)研究[J].基礎(chǔ)研究,2008,24(8):30-31.

    [7]雷 艷,黃起福,王永炎,等.論瘀毒阻絡(luò)是絡(luò)病形成的病理基礎(chǔ)[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),1999,22(2):8-9.

    [8]王 怡.動物類活血化瘀藥對血液流變性作用的比較研究[J].中藥藥理與臨床 1997,13(3):1-4.

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