從中醫(yī)脾癉角度評價OLETF大鼠發(fā)病特點*

甄 仲，常 柏 ，李 敏 ，劉文科，李修洋 ，于 波 ，仝小林

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，天津 300070）

“脾癉”最早見于《素問·奇病論》。書中記載：“此五氣之溢也，名曰脾癉。夫五味入口，藏于胃，脾為之行其精氣，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所發(fā)也，此人必數(shù)食甘美而多肥也。肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿。”本課題組在前期文獻研究的基礎(chǔ)上提出脾癉的形成和發(fā)展與代謝綜合征（MS）極為相似，是肥胖發(fā)展為多種心腦血管疾病的過渡階段[1-2]。

目前關(guān)于“脾癉”的探討尚不完善、不充分，尚缺乏適合的動物模型平臺，以便進行深入的研究，而自發(fā)性2型糖尿病大鼠（OLETF）以肥胖（中心型肥胖）起病，未采取人工干預(yù)造模，與人類多飲多食缺乏運動的生活方式導(dǎo)致MS發(fā)病具有一定的類似性，本實驗旨在通過對其肥胖、糖尿病前期、糖尿病期進行動態(tài)觀察，研究OLETF發(fā)病特點，探討其發(fā)病過程是否較好的體現(xiàn)MS的病變特點，也為深入研究脾癉理論提供新的實驗平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 以O(shè)LETF及同系非糖尿病對照大鼠（LETO）為實驗對象。OLETF組（即模型組）30只，LETO組（即正常組）30只，皆為雄性，4周齡，體質(zhì)量（80±10）g。由日本大冢制藥德島研究所引進,在無特定病原體級（SPF級）條件下單籠飼養(yǎng)，飼以標準飼料。環(huán)境溫度控制在22～25℃，濕度為（55±5）%，12/12 h 光照黑暗循環(huán)（光照時間 7∶00－19∶00），自由獲取食物和飲水。

1.2 指標及檢測

1.2.1 實驗動物體質(zhì)量 定期以電子計重器稱鼠體質(zhì)量并記錄，稱取時間為（周一）空腹、每間隔7 d，上午9:00。

1.2.2 口服糖耐量實驗 兩組大鼠均定期行口服葡萄糖耐量實驗（OGTT）。實驗前隔夜禁食15 h、不禁水，按2 g/kg予30%葡萄糖溶液灌胃。于空腹及糖負荷后30、60、90和120 min取血，以德國內(nèi)卡BIOSEN5030快速葡萄糖分析儀測定血糖值。血糖峰值>16.7mmo1/L和負荷后120min血糖>11.1mmol/L診為糖尿病，只具備上述一條為糖耐量減低[3]。血糖曲線下面積（AUC）計算：采用近似梯形的計算公式，0～120 min血糖AUC=1/2（0 min值＋120 min值）＋30 min值+60 min值+90 min值。

1.2.3 血脂、游離脂肪酸檢測 大鼠隔夜禁食12 h，次晨取血，離心取血清，-70℃保存?zhèn)錅y。游離脂肪酸（FFA）檢測采用比色法，使用南京建成生物公司試劑盒測試?？偰懝檀迹═C）采用酶法，甘油三酯（TG）采用乙酰丙酮顯色法，日立-7150全自動生化分析儀測定。

1.2.4 高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗 大鼠隔夜禁食，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（40 mg/kg），行右側(cè)頸總動脈和左側(cè)頸內(nèi)或頸外靜脈插管，動脈插管以取血測血糖，靜脈插管連接小三通管，先恒定輸注短效胰島素，當(dāng)血糖值超出基礎(chǔ)值±0.5 mmol/L的范圍時，即開始輸注濃度為20%葡萄糖，調(diào)整葡萄糖輸注速度（即葡萄糖輸注率，GIR），使血糖值控制在基礎(chǔ)值±0.5 mmol/L的范圍左右，如果血糖值超出基礎(chǔ)值±0.5 mmol/L的范圍，根據(jù)血糖值在最短的時間內(nèi)調(diào)整葡萄糖輸注率，使血糖恢復(fù)到基礎(chǔ)值±0.5mmol/L的范圍內(nèi)，達到穩(wěn)定狀態(tài)，將鉗夾處于穩(wěn)態(tài)的3個GIR值求平均值。

1.2.5 大鼠腹內(nèi)脂肪的采集 分別于16、30、42周剖殺部分實驗大鼠,取附睪、腸系膜、返折腹膜脂肪稱質(zhì)量，計為內(nèi)臟脂肪質(zhì)量，并計算內(nèi)臟脂肪質(zhì)量占體質(zhì)量百分比。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 16.0軟件作統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，服從正態(tài)分布的兩組間均數(shù)比較用t檢驗進行統(tǒng)計，偏態(tài)分布用秩和檢驗，以P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量的比較 隨著試驗周期延長，模型組與正常組體重均穩(wěn)定增長，自8周起，模型組體質(zhì)量明顯高于正常組（P<0.01）。見表1。

表1 實驗大鼠體質(zhì)量的變化(±sTab.1 The change of body weight in experiment rats(±sg

表1 實驗大鼠體質(zhì)量的變化(±sTab.1 The change of body weight in experiment rats(±sg

注：同周齡大鼠，模型組與正常組比較，##P<0.01，#P<0.05。

組別正常組模型組4周8周82.5±7.280.9±4.4234±19.3266±20.2##12周339.5±23.9442.8±24.3##16周375.9±28.4477.8±46.2##20周400.6±31.7512.9±34.8##24周443.7±50.7550.2±47.6##組別正常組模型組28周466.1±37.8573.7±57.4##30周490.5±23.8589.7±40.2##34周509.9±36.7611.7±30.1##38周522.5±33.9632.4±23.3##42周530.8±31.8638.4±53.3##

2.2 大鼠腹腔脂肪含量的比較 隨著實驗周期延長，實驗各組腹內(nèi)脂肪含量及脂體比均緩慢上升，模型組在16、30、42周3個時間點其腹內(nèi)脂肪含量較正常組明顯增加，脂體比亦顯著高于正常組。見表2。

表2 實驗大鼠腹內(nèi)脂肪含量、脂體比的比較(±sTab.2 Comparison of intrabdomenal fat content and corpus adiposum ratio in experiment rats(±s

表2 實驗大鼠腹內(nèi)脂肪含量、脂體比的比較(±sTab.2 Comparison of intrabdomenal fat content and corpus adiposum ratio in experiment rats(±s

注：同周齡大鼠，模型組與正常組比較，##P<0.01，#P<0.05。

周齡16周30周42周組別正常組模型組正常組模型組正常組模型組體質(zhì)量（g）375.9±28.4477.8±46.2##490.5±23.8589.7±40.2##530.8±31.8638.4±53.3##腹內(nèi)脂肪含量（g）11.8±3.719.8±6.9##13.9±2.428.7±8.2##15.9±3.636.6±9.1##腹脂/體質(zhì)量（%）3.17±1.154.54±2.38##3.71±0.715.22±1.94##3.93±0.646.2±1.54##

2.3 實驗大鼠口服糖耐量AUC比較 隨著實驗周期延長，模型組口服葡萄糖耐量葡萄糖曲線下面積（AUC）逐漸升高，正常組AUC變化不明顯，自12周起，模型組AUC顯著高于正常組。見表3。

表3 實驗大鼠葡萄糖耐量實驗AUC變化(±sTab.3 The GT-AUC change in experiment rats(±s

表3 實驗大鼠葡萄糖耐量實驗AUC變化(±sTab.3 The GT-AUC change in experiment rats(±s

注：同周齡大鼠，模型組與正常組比較，##P<0.01，#P<0.05。

組別正常組模型組4周27.1±6.526.8±3.712周26.9±3.340.1±11.2##16周28.1±4.850.2±15.8##30周29.3±3.457.9±7.6##34周29.4±2.963.6±9.1##38周30.3±1.866.9±7.4##42周29.8±3.578.2±11.9##

2.4 實驗各組高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗結(jié)果比較 分別于16、30、42周行正糖鉗夾檢測，3個時間點模型組大鼠穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率均較正常組下降（P＜0.05）。見表4。

表4 實驗各組高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗結(jié)果(±sTab.4 The result of right glucose ring clamp of hyperinsulinism in each experiment group(±s

表4 實驗各組高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗結(jié)果(±sTab.4 The result of right glucose ring clamp of hyperinsulinism in each experiment group(±s

注：同周齡大鼠，模型組與正常組比較，##P<0.01，#P<0.05。

周齡 組別16周30周42周正常組模型組正常組模型組正常組模型組穩(wěn)態(tài)葡萄糖（mmol/L）5.0±0.35.0±0.25.0±0.25.0±0.45.0±0.35.0±0.2胰島素輸注率[mU/（kg·min）]8.08.08.08.08.08.0葡萄糖輸注率（GIR）[mg/（kg·min）]25.9±6.5118.9±6.87##25.6±5.6614.8±4.33##23.5±3.898.85±2.76##

2.5 實驗各組血脂變化情況 隨著實驗周期延長，實驗各組血清甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL－C）、游離脂肪酸（FFA）水平均緩慢上升，16、30、42周時，模型組的血清甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸水平均較正常組顯著增高（P＜0.05），30 周時 HDL－C 水平較正常組下降（P＜0.05）。見表5。

表5 實驗各組血脂情況比較(±sTab.5 Comparison of blood fat condition in each experiment group(±smmol/L

表5 實驗各組血脂情況比較(±sTab.5 Comparison of blood fat condition in each experiment group(±smmol/L

注：同周齡大鼠，模型組與正常組比較，##P<0.01，#P<0.05。

時間16周30周42周組別正常組模型組正常組模型組正常組模型組TG 0.35±0.110.66±0.15##0.37±0.230.98±0.23##0.38±0.111.94±0.35##TC 1.49±0.881.76±0.49##1.69±0.382.58±0.78##1.72±0.473.29±0.59##HDL-C 0.79±0.130.72±0.090.97±0.150.82±0.19#0.94±0.170.98±0.08 FFA 0.52±0.0.90.99±0.47##0.58±0.131.12±0.37##0.57±0.091.25±0.42##

3 討論

3.1 OLETF是符合MS特點的自發(fā)動物模型 OLETF是1984年由大冢制藥德島研究所建立的自發(fā)性2型糖尿病模型[4]，既往多用于糖尿病的基礎(chǔ)研究中。首先本研究動態(tài)觀察了OLETF從肥胖至糖尿病前期至糖尿病期的過程，結(jié)果顯示隨著實驗周期延長，兩組大鼠體質(zhì)量均穩(wěn)定增長，腹內(nèi)脂肪含量及脂體比均緩慢上升。自第8周起，模型組大鼠體質(zhì)量明顯高于 LETO 組（P<0.01），在第 16、30、42周 3個時間點其腹內(nèi)脂肪含量較LETO組明顯增加，脂體比亦顯著高于LETO組。說明OLETF以肥胖起病，尤其是腹內(nèi)脂肪含量及脂體比逐漸升高，與人類腹圍增加類似。其次本研究以金標準正糖鉗夾實驗測定胰島素抵抗（IR）情況，本研究于16、30、42周3個時間點行正糖鉗夾檢測，結(jié)果顯示模型組大鼠穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率均較正常組下降（P＜0.05），而正常組大鼠胰島素抵抗始終變化不明顯。OLETF葡萄糖輸注率持續(xù)顯著下降，表明了OLETF的IR情況逐漸加重。另外，本研究中OLETF的糖代謝、脂代謝紊亂亦逐漸發(fā)生，與文獻結(jié)果類似。

即OLETF具備肥胖尤其是中心型肥胖、胰島素抵抗、血糖代謝紊亂、血脂代謝紊亂等特點，基本體現(xiàn)了世界衛(wèi)生組織（WHO，1999）、中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)會（2004）、國際糖尿病聯(lián)盟（IDF，2005）等對MS定義的特征，且明確體現(xiàn)了其核心機制IR和中心性肥胖[5]。

3.2 OLETF可以考慮作為脾癉的動物模型 脾癉如《素問·奇病論》中所云：“此肥美之所發(fā)也，此人必數(shù)食甘美而多肥也。肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿。”亦如《素問·通評虛實論》中描述：“凡治消癉、仆擊、偏枯、痿厥、氣滿發(fā)逆，甘肥貴人則膏粱之疾也?！笔侵高^食肥甘厚味引起的肥胖，可導(dǎo)致“仆擊”、“偏枯”、“氣滿發(fā)逆”等一系列心腦血管疾病，較清晰的描述了代謝綜合征患者往往多食少動，肥胖起病，繼而引發(fā)多種肥胖相關(guān)疾病，最終導(dǎo)致多種嚴重并發(fā)癥。本實驗研究顯示OLETF自發(fā)起病，在同一種實驗動物上先后體現(xiàn)肥胖、代謝綜合征、糖尿病前期、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥等系列疾病特征，因而具有不可替代的獨特優(yōu)勢，不僅可用作MS研究的較好模型，其發(fā)病過程較好的模擬了脾癉發(fā)病過程，較好體現(xiàn)了脾癉的病變特征，可考慮作為進一步研究中醫(yī)脾癉理論及機制的實驗動物平臺。

3.3 思考與展望 更具有探索意義的是，雖然實踐經(jīng)驗的積累總結(jié)為中醫(yī)發(fā)展的主要手段，然而要進一步闡釋中醫(yī)藥理論的科學(xué)內(nèi)涵，還應(yīng)借助現(xiàn)代科學(xué)的理論與方法，包括借助動物實驗手段[6]，如何建立既符合西醫(yī)病、綜合征以及病理變化過程又可體現(xiàn)中醫(yī)學(xué)相關(guān)理論特點的動物模型，對中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合研究中醫(yī)藥作用機制以及中醫(yī)理論內(nèi)涵具有一定的重要意義。筆者擬拋磚引玉，以待學(xué)者、同道共同努力，通過實驗動物模型平臺及相關(guān)機制研究，為中醫(yī)理論的豐富和創(chuàng)新發(fā)展作出貢獻。

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