葡萄糖氧化酶-過氧化物酶改良法的建立——血糖測定時間窗口的探討

朱傳江，劉 蘋

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

1 材料

1.1 動物 Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量240～280 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號:SCXK(京)2005-0013。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、過氧化物酶和葡萄糖氧化酶，購自Sigma-Aldrich公司。檸檬酸、檸檬酸三鈉、2-甲基苯胺和葡萄糖，購自北京化學(xué)試劑公司。草酸鉀、三氯醋酸和4-氨基安替吡啉(4-AA)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器 紫外可見分光光度計(jì)，UV-2000型，尤尼科(上海)儀器有限公司產(chǎn)品。離心機(jī)，TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。pH計(jì)，Delta 320，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 檸檬酸-檸檬酸三鈉溶液 總體積500 ml。準(zhǔn)確稱取檸檬酸0.7350 g，檸檬酸三鈉13.620 g，加蒸餾水至500 ml，測pH值為6.11(范圍在5.4～7.0內(nèi)即可)。

2.1.2 GOD-POD溶液 總體積200 ml。準(zhǔn)確稱取4-AA 10 mg，加檸檬酸-檸檬酸三鈉溶液199.7 ml，2-甲基苯胺0.05 ml，POD(1 040 IU·ml-1)0.125 ml，GOD(1 040 IU·ml-1)0.125 ml，4℃可保存1 wk，如顯淡紅色，不宜使用。

2.1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖，用蒸餾水配成 3.75、7.5、15、30、60、120、240、480 mg·dl-1不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存，過夜后使用。

2.1.4 STZ溶液 濃度為55 mg·kg-1，用0.05 mol·L-1檸檬酸溶液(pH4.5)現(xiàn)配現(xiàn)用。

徐州境內(nèi)河網(wǎng)交錯，水系復(fù)雜。大運(yùn)河傍城而過，故黃河貫穿東西，河道縱橫貫通，水庫星羅棋布；以故黃河為界，分沂沭泗、故黃河及濉安河三個水系。歷史上徐州以戰(zhàn)場、煤場、工廠著名，水資源匱乏，洪澇旱漬災(zāi)害頻發(fā)，“水多、水少、水臟”問題突出。徐州市委、市政府立足市情水情，堅(jiān)持把生態(tài)文明建設(shè)融入經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展全過程。2011年市委、市政府明確提出要大力建設(shè)生態(tài)文明；2012年《徐州市生態(tài)市建設(shè)規(guī)劃（2011—2015）》審議通過，確定了水生態(tài)文明建設(shè)的宏偉藍(lán)圖；徐州市“十二五”規(guī)劃把綠色增長列為“六大發(fā)展戰(zhàn)略”之一，對水生態(tài)文明建設(shè)進(jìn)行了全面部署。

2.2 高血糖模型大鼠制備及血糖測定方法 取Wistar大鼠，腹腔注射新鮮配制的STZ溶液(濃度為55 mg·kg-1，注射體積為5 ml·kg-1)，1 wk后測禁食3 h后的血糖，選取血糖值在180 mg·dl-1以上的模型大鼠用于GOD-POD改良法實(shí)驗(yàn)。

自模型大鼠內(nèi)眥靜脈叢取血，置凝集盤(1%草酸鉀抗凝)中，取0.06 ml置于預(yù)先加有5%三氯醋酸0.36 ml的EP管中，混勻，離心3 000 r·min-1×10 min，取上清液0.1 ml置10 ml試管中(冰上操作)，加入GOD-POD溶液2 ml，混勻。同時設(shè)空白對照管和標(biāo)準(zhǔn)樣品管，前者以同體積的水代替血樣，后者以同體積的系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液代替血樣。各管37℃溫浴30 min(顯色反應(yīng))，然后取出室溫下(20～22)℃靜置反應(yīng)一定時間，于550 nm處測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出血糖值。

Tab 1 Effects of different wave lengths on the optical density of serial concentrations of glucose

Tab 2Effects of different GOD-POD concentrations on the optical density of serial concentrations of glucose(±s，n=3)

Tab 2Effects of different GOD-POD concentrations on the optical density of serial concentrations of glucose(±s，n=3)

GOD-POD concentration/IU·ml-1 OD/mg·dl-1 30 60 120 240 480 720r b 65 0.033±0.004 0.068±0.004 0.126±0.009 0.264±0.018 0.539±0.037 0.767±0.072 0.999 926.930 130 0.059±0.006 0.124±0.014 0.240±0.025 0.493±0.055 1.024±0.105 1.459±0.153 0.999 485.992 260 0.093±0.006 0.202±0.017 0.394±0.032 0.818±0.064 1.636±0.132 2.216±0.134 0.998 317.210 520 0.132±0.009 0.285±0.017 0.552±0.036 1.157±0.071 2.178±0.093 2.516±0.026 0.982 265.891 1 040 0.159±0.003 0.343±0.012 0.659±0.014 1.369±0.060 2.381±0.043 2.565±0.020 0.966 253.827

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1 不同波長對測定結(jié)果的影響 使用已知系列濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及1 040 IU·ml-1GOD-POD溶液，按“2.2”項(xiàng)分別測定波長為550 nm和505 nm的OD值，求出OD值與血糖值的相關(guān)系數(shù)r，見Tab 1。

由Tab 1可看出波長為550 nm時，葡萄糖濃度在3.75～480 mg·dl-1范圍內(nèi)與OD值對應(yīng)良好，隨著葡萄糖濃度倍增，OD值也大致成倍遞增，相關(guān)系數(shù)(r)達(dá)到0.999。而波長為505 nm時，葡萄糖濃度在15～480 mg·dl-1范圍內(nèi)與OD值對應(yīng)良好，但低段3.75～7.5對應(yīng)不好，提示用550 nm波長測定靈敏度高于用505 nm。故GOD-POD改良法以及本文以下實(shí)驗(yàn)中，測定波長均選用550 nm。

2.3.2 不同GOD-POD濃度對測定結(jié)果的影響 在GODPOD法測定樣品葡萄糖含量時，酶的量需足夠才能使葡萄糖完全氧化，故應(yīng)對GOD和POD的濃度進(jìn)行優(yōu)化。按1∶1比例配制不同濃度的GOD-POD溶液，按“2.2”項(xiàng)測定系列濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中溫浴后室溫靜置時間為90 min。結(jié)果見Tab 2。

從 Tab 2 可見，GOD-POD 濃度分別為 65、130、260、520、1 040IU·ml-1時，葡萄糖濃度(30～720 mg·dl-1)與OD值大多對應(yīng)良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.966～0.999，提示 GODPOD濃度取65 IU·ml-1或130 IU·ml-1已能滿足對葡萄糖的氧化要求，且有較高的斜率(b)值。故下一步實(shí)驗(yàn)中，選擇GOD-POD濃度為130 IU·ml-1，觀察顯色后室溫放置不同時間(0～300 min)對高血糖模型大鼠血樣測定結(jié)果的影響。

2.3.3 顯色反應(yīng)穩(wěn)定時段的選擇 取9只STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠，從內(nèi)眥靜脈采血0.06 ml，5%三氯醋酸(0.36 ml)沉淀蛋白后離心取上清液0.15 ml，加入GOD-POD(130 IU·ml-1)溶液3 ml，溫浴(37℃)30 min，取出室溫放置 0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 min，并分別在這些時間點(diǎn)測定 OD 值，依次求出0～90、30～120、60～150、90～180、120～210、150～240、180 ～270、210 ～300 min時間段OD均值和CV均值。結(jié)果見Tab 3。

Tab 3 Observation of a stable period of time for OD detection(GOD-POD:130 IU·ml-1;±s，n=9)

Tab 3 Observation of a stable period of time for OD detection(GOD-POD:130 IU·ml-1;±s，n=9)

Period of time/min OD CV/%0～90 0.505±0.126 35.1±1.4 30～120 0.636±0.157 23.4±0.9 60～150 0.744±0.183 18.8±0.8 90～180 0.846±0.205 14.3±0.9 120～210 0.934±0.223 11.5±1.0 150～240 1.010±0.238 9.2±0.8 180～270 1.075±0.250 7.3±0.6 210～300 1.129±0.260 5.5±0.6

Tab 3顯示當(dāng)酶濃度為130 IU·ml-1時，CV均值在5.5%以上，隨著樣品放置時間延長，OD均值逐漸增大，CV均值逐漸減小，5 h內(nèi)沒有相對穩(wěn)定的測定區(qū)間。這提示酶濃度為130 IU·ml-1，雖然相關(guān)系數(shù)r值達(dá)到0.999、斜率(b)值達(dá)到486(Tab 2)，酶用量節(jié)省，但操作中，由于缺乏顯色相對穩(wěn)定的時段(測定窗口)，結(jié)果的準(zhǔn)確性和組間可比性難以得到保證。因此，以下實(shí)驗(yàn)調(diào)整GOD-POD濃度為1 040 IU·ml-1，按上法測定不同時間段(90 min時長)的OD均值和CV均值，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，觀察并選擇顯色穩(wěn)定時段，結(jié)果見Tab 4。

Tab 4數(shù)據(jù)表明，當(dāng)GOD-POD濃度為1 040 IU·ml-1時，CV均值從0～90 min時段到90～180 min時段逐漸減小，而從90～180 min時段到210～300 min時段逐漸增大，90～180 min時段最小，3次實(shí)驗(yàn)分別為 0.8%、0.9%、0.8%，也就是說這區(qū)間顏色變化相對較小，而且有90 min時長，便于完成對較大樣本的測定。由此可見，1 040 IU·ml-1的GOD-POD濃度和反應(yīng)管溫浴后室溫下放置90 min，并在90～180 min時段(時間窗口)內(nèi)測定OD值較合適。

2.3.4 GOD-POD比例不同對測定結(jié)果的影響 GOD在第1步反應(yīng)中催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，其特異性很高，只針對β-D葡萄糖。而POD在第2步反應(yīng)中，作用過氧化氫釋放出氧，使4-AA與2-甲基苯胺氧化縮合，生成紅色醌類化合物，其特異性較差［5］，故需對二者的比例進(jìn)行優(yōu)化。取GOD和POD溶液，濃度均為1 040 IU·ml-1，分別按1∶1、1∶2、2∶1進(jìn)行配制，按2.2項(xiàng)測定已知濃度的系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值，并求出r值，結(jié)果見Tab 5。

結(jié)果顯示，GOD和POD分別取1∶1、1∶2和2∶1比例時，測得的OD值和相關(guān)系數(shù)r值，幾無差別，故將GOD和POD的比例選定為1∶1。

Tab 4Observation of a stable period of time for OD detection(GOD-POD:1 040 IU·ml-1;±s，n=9)

Tab 4Observation of a stable period of time for OD detection(GOD-POD:1 040 IU·ml-1;±s，n=9)

ND:not determined

Period of time/minⅠOD CV/%ⅡOD CV/%ⅢOD CV/%0～90 1.735±0.344 9.0±1.7 1.736±0.386 10.9±2.2 1.768±0.353 10.8±2.1 30～120 1.825±0.354 4.3±1.0 1.844±0.397 4.5±1.1 1.876±0.363 4.3±0.9 60～150 1.867±0.358 1.6±0.5 1.892±0.401 1.8±0.8 1.918±0.367 1.6±0.6 90～180 1.877±0.358 0.8±0.3 1.907±0.402 0.9±0.6 1.929±0.368 0.8±0.4 120～210 1.865±0.356 1.6±0.5 1.909±0.402 0.9±0.3 1.921±0.368 1.3±0.4 150～240 1.840±0.354 2.4±0.5 1.897±0.402 1.5±0.5 1.898±0.368 2.1±0.8 180～270 ND ND 1.874±0.401 2.1±0.8 1.867±0.366 2.6±0.8 210～300 1.775±0.346 3.2±0.7 1.844±0.399 2.7±1.0 1.828±0.364 3.1±1.0

Tab 5Effects of the different proportion of GOD to POD on the optical density of serial concentrations of glucose(±s，n=3)

Tab 5Effects of the different proportion of GOD to POD on the optical density of serial concentrations of glucose(±s，n=3)

GOD ∶POD OD/mg·dl-1 30 60 120 240 480r 1∶1 0.151±0.002 0.253±0.002 0.640±0.012 1.218±0.013 2.487±0.012 0.9996 1∶2 0.142±0.003 0.241±0.002 0.600±0.004 1.176±0.047 2.479±0.009 0.9995 2∶1 0.155±0.001 0.260±0.001 0.652±0.005 1.237±0.003 2.510±0.005 0.9996

2.3.5 線性范圍 配制葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液:720，480，240，120，60，30，15，7.5，3.75 mg·dl-1，以 GOD-POD 改良法測定其OD值，每一濃度測定3次，取均值，繪制葡萄糖濃度對OD值的曲線，見Fig 1。

Fig 1 Curve of glucose concentration-optical density

Fig 1顯示，GOD-POD改良法在3.75～480 mg·dl-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液范圍內(nèi)線性良好，此段線性方程為Y=199.267X-3.043，r值為0.998，能滿足血糖實(shí)測需求。

3 討論

通過對血糖測定中一些重要影響因素的優(yōu)化，我們在林志共等［4］建立的小鼠血糖GOD-POD原法的基礎(chǔ)上，建立了大鼠血糖GOD-POD改良法。改良法在GOD和POD的濃度及比例、血糖測定窗口、線性范圍等方面都較原法有了較大改進(jìn)。

GOD-POD濃度和測定窗口選擇在原法中，GOD的濃度為30 IU·ml-1，而POD的濃度在文獻(xiàn)中沒有明確［4］。我們按1∶1考察了GOD和POD從65～1 040 IU·ml-1不同濃度對血糖測定結(jié)果的影響。發(fā)現(xiàn)GOD和POD的濃度為65 IU·ml-1已能完成對大鼠血樣中葡萄糖的氧化，可獲得非常好的相關(guān)系數(shù)r值和斜率b值(Tab 2)。調(diào)整GOD和POD的濃度為2∶1或1∶2，對測定的結(jié)果影響不大(Tab 5)。至此，GOD和POD的濃度似應(yīng)選擇65 IU·ml-1或130 IU·ml-1以節(jié)省酶的用量。但繼而進(jìn)行的顯色反應(yīng)后OD測定時段的選擇實(shí)驗(yàn)表明，65 IU·ml-1或130 IU·ml-1的GOD和POD濃度并不合適。這是因?yàn)轱@色反應(yīng)后沒有相對穩(wěn)定的OD測定區(qū)間(Tab 3)。

對于一個樣本數(shù)達(dá)到50～100管的血糖測定實(shí)驗(yàn)，在顯色反應(yīng)相對穩(wěn)定的時段(即測定窗口，約需60～90 min)內(nèi)進(jìn)行OD測定，才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和組間可比性。當(dāng)GOD和POD的濃度為130 IU·ml-1時，從0～300 min(室溫靜置時間)OD值一直在增加，時段CV值最小在5%以上，其中90～180 min時段的CV值高達(dá)14.3%(Tab 3)，沒有出現(xiàn)一個顯色反應(yīng)相對穩(wěn)定區(qū)間以供測定。這可能由于酶量低與底物反應(yīng)速度達(dá)到終點(diǎn)較慢所致。當(dāng)GOD和POD的濃度為1 040 IU·ml-1時，90～180 min時段的 CV值最小(0.846% ±0.205%，n=3，見 Tab 4)，這是一個時長為90 min的顯色相對穩(wěn)定區(qū)間，基本能滿足較大樣本的OD測定。這時的酶量較大，催化底物較快達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，因而出現(xiàn)顯色相對穩(wěn)定區(qū)間。這點(diǎn)與原法大不相同。原法要求在顯色后室溫放置60 min內(nèi)比色完畢［4］。而本研究對高血糖樣品測定表明，在GOD和POD的濃度為1 040IU·ml-1時，OD值在0～90 min內(nèi)的CV高達(dá)9%以上(Tab 4)，因此如果在顯色后室溫放置60 min內(nèi)進(jìn)行比色測定，則無法保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和組間可比性。其原因可能在于原法測定的是正常小鼠血糖，而改良法測定的是糖尿病模型大鼠血糖。這提示不同來源的血樣，正常的或病理的，其中的葡萄糖含量不同，所需的GOD-POD濃度不同，測定窗口將隨之發(fā)生變化。這也說明研究針對于不同動物(包括大鼠和小鼠、正常和病理)的血糖測定方法是有必要的。另外，在藥理學(xué)研究方法的代表性專著［6-7］、相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以及市售血糖測定試劑盒說明書中，作者尚未見對血糖測定窗口的記述。因此本文對這一窗口的詳細(xì)探索和確定，為血糖測定方法的完善提供了寶貴的資料。

方法學(xué)考查原法顯示葡萄糖濃度在5～30 mg·dl-1范圍相關(guān)系數(shù)r值達(dá)到0.999。改良法大大拓寬了線性范圍，在3.75～480 mg·dl-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)值達(dá)0.998(Fig 1);在3.75～720 mg·dl-1范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)值略有降低，為0.966(Tab 2)。該濃度范圍基本覆蓋了糖尿病模型大鼠的高血糖水平。同時，改良法的血糖最低檢測濃度可達(dá)3.75 mg·dl-1(Tab 1)，日間變異小于4%，這些說明改良法具有較高的靈敏度和精確度。此外，改良法中模型大鼠血樣中的葡萄糖值在5 d內(nèi)基本穩(wěn)定，GOD-POD溶液在14 d內(nèi)穩(wěn)定可用(4℃，結(jié)果未顯示)。實(shí)測結(jié)果表明，改良法能滿足糖尿病模型大鼠血糖測定的要求。這無疑將對糖尿病的防治和降糖藥物的研發(fā)產(chǎn)生積極的作用。

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