雌激素對(duì)慢性內(nèi)臟痛雌鼠的敏化作用及其機(jī)制

陳 瑜，唐 影，焦海霞，林 春

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)為女性易罹患的以反復(fù)腹痛與胃腸功能改變?yōu)樘卣鞯呐R床常見?。?］。據(jù)報(bào)道［2－4］女性患病率為男性的2～3倍，而且在圍月經(jīng)期癥狀加重，藥物或手術(shù)去除月經(jīng)周期后可減輕癥狀。我們前期的研究表明［5］IBS模型雌鼠內(nèi)臟痛覺較模型雄鼠敏感，且與其血清雌激素水平正相關(guān)。雌激素受體分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中許多與痛覺有關(guān)的區(qū)域中［6］。有報(bào)道［7］，在急性內(nèi)臟痛的動(dòng)物模型上，雌激素受體和NMDA受體的NR1亞單位共表達(dá)，NMDA受體的激活在痛覺過敏以及異常痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著重要作用。那么，在以慢性內(nèi)臟痛為特征的IBS中，雌激素與NMDA受體有無關(guān)系呢?它是否通過改變NMDA受體的功能從而影響內(nèi)臟痛呢?因此，本研究觀察比較了雌激素水平對(duì)IBS模型雌鼠內(nèi)臟高敏感性的影響，同時(shí)使用D(-)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid(AP-5，NMDA受體阻斷劑)脊髓內(nèi)給藥的方法，比較高、低雌激素組IBS模型大鼠鎮(zhèn)痛作用的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生♀ SD大鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2007-0005，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào):SYXK(閩)2004-0007］。大鼠自由飲食，自然光照，模型組在出生后8～15 d接受結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)刺激，然后飼養(yǎng)至8周后開始各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前18 h動(dòng)物禁食不禁水。模型制備見后，對(duì)照鼠除未進(jìn)行新生期結(jié)直腸擴(kuò)張刺激外，其余處理同模型鼠。模型組與對(duì)照組再各自設(shè)立高雌激素組(E2組)與低雌激素組(OVx組)，E2組與OVx組大鼠均去卵巢，E2組大鼠在測(cè)量內(nèi)臟痛前2 d腹腔注射雌激素100 μg(溶于 200 μl紅花油)［7］，OVx 組大鼠則不補(bǔ)充雌激素。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 異戊巴比妥鈉、β-Estradiol 3-benzoate(Sigma No.E8875)，Ap-5(Sigma No.E8054)，紅花油，生理鹽水，乙醚，頭孢曲松鈉。

人血管重建氣囊20 mm×2.5 mm(美國)，RM6240多道生理記錄儀(成都儀器廠)，針形電極，血壓計(jì)，自制結(jié)直腸加壓氣囊。

1.3 大鼠腸易激綜合征模型［8］4窩模型鼠在出生后8～15 d，每天接受一次CRD刺激。將人血管重建氣囊全部插入幼鼠結(jié)直腸中，充氣擴(kuò)張產(chǎn)生60 mmHg壓力，維持l min后放氣撤出，此后正常飼養(yǎng)至成年。模型鼠13只，其中高雌激素組6只，低雌激素組7只。對(duì)照鼠共14只，其中高、低雌激素組各7只。

1.4 腹外斜肌放電測(cè)量 安靜且室溫24℃ ～26℃條件下，依據(jù)Morteau等［9］的方法，將雙極電極固定于大鼠腹外斜肌上，用RM6240多道生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄大鼠腹外斜肌放電活動(dòng)(參數(shù)設(shè)置:高頻濾波3 kHz，時(shí)間常數(shù)0.001 s，采樣頻率為20 kHz，靈敏度 200 μV，走紙速度 200 ms/div)。大鼠清醒后適應(yīng)30 min，首先記錄其腹外斜肌基礎(chǔ)放電，然后通過加壓氣囊對(duì)大鼠結(jié)直腸予以CRD(壓力為20、40、60、80 mmHg，持續(xù) 10 s，間隔 4 min)，記錄其在不同壓力下的腹外斜肌放電。

1.5 鞘內(nèi)插管 異戊巴比妥鈉麻醉，大鼠自然俯臥，剪毛，消毒。在大鼠背部髂腰脊連線之中點(diǎn)稍下方摸到第6腰椎間隙，以其為中心做背部正中縱切口。取18 cm的PE-10聚乙烯管，在一端3 cm處用油性筆做標(biāo)記，穿入9號(hào)針筒的針頭內(nèi)。針頭沿兩個(gè)椎體間隙插入椎管，見大鼠有甩尾現(xiàn)象時(shí)應(yīng)停止進(jìn)針，向前推送PE-10聚乙烯管2～3.5 cm，即到達(dá)脊髓L6～S2節(jié)段。退出針頭，使PE-10聚乙烯管留在椎管中，固定插管。將插管另一端經(jīng)皮下由大鼠項(xiàng)部穿出，并固定在項(xiàng)部，保持其直立。每只大鼠腹腔注射頭孢曲松鈉0.25 g(溶于1 ml生理鹽水)，預(yù)防術(shù)后感染。

1.6 大鼠去卵巢術(shù) 異戊巴比妥鈉麻醉，大鼠仰臥位固定，下腹正中2 cm切口，延腹白線切開肌肉層，打開腹腔，于下腹部找到兩側(cè)輸卵管，沿輸卵管找到兩側(cè)卵巢，于卵巢下方結(jié)扎輸卵管，再切除卵巢。分別縫合腹肌及腹部皮膚。

1.7 AP-5鞘內(nèi)給藥并記錄其抑制效應(yīng) 在大鼠去卵巢術(shù)后的10～20 d，先按前述方法測(cè)定大鼠對(duì)80 mmHg CRD刺激的腹外斜肌放電。乙醚麻醉后，用微量加樣器向椎管內(nèi)注入AP-5 100 nmol(溶于10 μl生理鹽水)，并用5 μl生理鹽水將殘留藥物沖入椎管內(nèi)。分別在給藥后5、10、15、30 min測(cè)定大鼠對(duì)80 mmHg CRD刺激的腹外斜肌放電反應(yīng)，并計(jì)算其抑制百分比［7］。計(jì)算方法如下:抑制百分比 =(給藥前的放電－給藥后的放電)/給藥前的放電×100%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 高雌激素模型鼠的腹外斜肌放電水平高于低雌激素模型鼠 在20 mmHg的CRD壓力下，高雌激素模型鼠的腹外斜肌放電水平高于低雌激素模型鼠，兩組差別有顯著性(P＜0.05)，在40～80 mmHg的CRD壓力下，差別均無顯著性(Fig 1);然而高、低雌激素對(duì)照鼠在各個(gè)水平的CRD壓力下腹外斜肌放電水平差別均無顯著性。

2.2 AP-5的抑制作用在高、低雌激素模型鼠之間無明顯差別 AP-5的抑制作用在5 min時(shí)最強(qiáng)，隨時(shí)間延長漸漸減弱。在高雌激素模型鼠與低雌激素模型鼠3個(gè)給藥時(shí)間點(diǎn)(5、10、15 min)，腹外斜肌放電反應(yīng)程度均低于給藥前，P值均＜0.05(Fig 2)。模型鼠高、低雌激素兩組之間在AP-5給藥5～30 min內(nèi)，抑制百分比的差別無顯著性(P＞0.05)，說明雌激素水平高低對(duì)NMDA受體的功能沒有明顯影響。

Fig 1 Comparism of electric discharge of EOMA between high estrogen and OVx model rats*P＜0.05 vs the OVx model rats

Fig 2 The inhibited effect by intrathecal administration of AP-5 on OVx and E2 model ratsB:before AP-5 administration;A5:5 minutes after AP-5 administration;A10:10 minutes after AP-5 administration;A15:15 minutes after AP-5 administration;A30:30 minutes after AP-5 administration.*P ＜0.05 vs the OVx B;#P＜0.05 vs the E2 B

3 討論

本研究顯示高雌激素模型鼠的內(nèi)臟痛較低雌激素模型鼠敏感，說明雌激素對(duì)IBS模型鼠慢性內(nèi)臟痛覺敏化具有促進(jìn)作用，這與我們以往的研究結(jié)果一致［5］。而高雌激素與低雌激素對(duì)照鼠之間的內(nèi)臟痛沒有明顯差別，說明高雌激素可造成模型鼠內(nèi)臟痛高敏，卻不能引發(fā)對(duì)照鼠的內(nèi)臟痛高敏。這提示模型雌鼠可能存在雌激素引發(fā)內(nèi)臟痛敏化的機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)［10］在胃腸道和腦－腸軸都有雌激素受體分布。早期Papka等［11］用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元、迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)的感覺纖維、盆神經(jīng)節(jié)的副交感神經(jīng)元都有雌激素α和β受體的mRNA轉(zhuǎn)錄，近年又有證據(jù)顯示［12］雌激素影響軀體和內(nèi)臟感覺傳遞。究竟雌激素是通過何種途徑影響軀體和內(nèi)臟感覺傳遞的?Tang等［7］在急性內(nèi)臟痛研究中發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)給予NMDA受體拮抗劑AP-5，能減輕內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反應(yīng)，其程度在低雌激素大鼠大于高雌激素大鼠，提示雌激素可能通過激活脊髓中NMDA受體的功能，增加大鼠的內(nèi)臟痛敏感性。

谷氨酸為腦和脊髓內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，NMDA受體為興奮性氨基酸受體的一種，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)通過各種膜門控離子通道產(chǎn)生突觸后效應(yīng)。NR1和NR2亞單位的不同組合決定了NMDA受體特定通道的活性。NR1是NMDA受體通道活性所必須的，而NR2具有調(diào)節(jié)通道活性的作用。NMDA受體在脊髓中主要存在于背角。脊髓過度興奮和持久疼痛的發(fā)生涉及NMDA受體功能活化，NMDA受體功能增強(qiáng)和通道開放率直接有關(guān)［13］。NMDA受體NR2B亞單位可能參與慢性內(nèi)臟痛外周與脊髓痛覺敏感的過程［14］性激素可通過調(diào)節(jié)谷氨酸受體表達(dá)或翻譯后修飾，改變腦內(nèi)谷氨酸受體傳遞［15］。有研究表明［16］雌激素增加了NMDA受體介導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元興奮。然而本研究結(jié)果表明，在慢性內(nèi)臟高敏的大鼠鞘內(nèi)給予NMDA受體拮抗劑AP-5，可減輕內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反應(yīng)，且在低雌激素大鼠與高雌激素大鼠之間差異無顯著性，與Tang等研究結(jié)果不同。這可能是由于慢性內(nèi)臟痛的發(fā)病機(jī)制與急性內(nèi)臟痛的發(fā)病機(jī)制不同所致(Tang等［7］研究所用的是急性內(nèi)臟痛模型)。谷氨酸受體可分為NMDA受體、AMPA受體和KA受體、代謝型谷氨酸受體和L-AP4受體等。有報(bào)道［16］體內(nèi)非 NMDA受體可能參與介導(dǎo)IBS慢性內(nèi)臟痛敏，因此我們推測(cè)，雌激素調(diào)節(jié)脊髓NMDA受體功能可能不是慢性內(nèi)臟痛覺敏化的主要因素?？傊诼詢?nèi)臟高敏大鼠中，雌激素促進(jìn)慢性內(nèi)臟高敏的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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