氧化還原調(diào)控在紫檀芪誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中的作用

王曉琴，王振華，劉 梅，張 波

在尋找抗癌藥物過程中，膳食源性多酚類物質(zhì)因容易獲取且不良反應(yīng)較低而成為人們關(guān)注的目標(biāo)［1］。這使得來源于葡萄等植物的芪類物質(zhì)(stilbenes)成為抗腫瘤藥物研究的一個熱點(diǎn)。近年來，白藜蘆醇(芪三酚)作為芪類物質(zhì)的代表被證明具有很好的抗氧化及抗腫瘤活性［2］。白藜蘆醇甲基化后的產(chǎn)物紫檀芪(Pterostilbene，F(xiàn)ig 1)也被發(fā)現(xiàn)具有較好的體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性［3］。但紫檀芪的抗腫瘤機(jī)制研究較少，尤其是在調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)及氧化還原敏感型凋亡通路等方面尚未有研究。因此本研究擬以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為模型，研究氧化還原調(diào)控在紫檀芪誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過程中的作用及其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的影響。

Fig 1 Structure of trans-pterostilbene

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所。紫檀芪Trans-pterostilbene(Pte)、過氧化氫酶(CAT)、GSH合成前體物質(zhì)——N-乙酰半胱氨酸(NAC)、超氧陰離子淬滅劑——Tempol(Tmp)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫陽性對照藥——反式4，5-二羥基-1，2-二噻烷(DTTox)、谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制子 L-S，R-buthionine sulfoximine(BSO)、0.25% 胰酶-EDTA溶液、硫異氰酸羅丹明(SRB)、DMSO、Hoechst、PI、H2DCFDA 均購自 Sigma公司。CMFDA 試劑盒購自Invitrogen公司。SDNAClear核酸染料購自BBI。小牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。DMEM為Hyclone公司產(chǎn)品。TRIzol試劑盒(UNIQ-10)購自上海生工，RevertAid H Minus反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司。紫檀芪溶解在DMSO中配制成200 mmol·L-1母液，4℃保存。

1.2 主要儀器 蔡司倒置熒光顯微鏡(德國)，凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR(BIO-RAD，美國)，PCR儀(Enppendorf，德國)，熒光酶標(biāo)儀 Varioskan Flash(Thermo，美國)用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)條件 HeLa細(xì)胞于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含有體積分?jǐn)?shù)為10%的熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)液。指數(shù)生長期細(xì)胞用于藥物處理。

1.4 SRB法檢測紫檀芪對HeLa細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞用Fig 2所示不同濃度紫檀芪處理24、48、72 h后，以SRB方法在酶標(biāo)儀上測定細(xì)胞反應(yīng)液的OD值(490 nm)并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率［4］。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 通過DNA特異熒光染料染色觀察核凋亡小體形態(tài)(Hoechst 33258)。通過照片觀察出現(xiàn)核凋亡細(xì)胞數(shù)來進(jìn)行細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)，每份數(shù)據(jù)至少統(tǒng)計(jì)400個細(xì)胞。DNA ladder通過瓊脂糖凝膠電泳(1.2%)并使用SDNAClear核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。細(xì)胞計(jì)數(shù)通過Hoechst/PI雙染熒光法來進(jìn)行測算［5］。細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作如下:根據(jù)測定5×106到5×103細(xì)胞的Hoechst(1.15 mg·L-1)熒光值變化繪制總細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線;根據(jù)對同樣數(shù)目細(xì)胞的溫和裂解后PI(20 mg·L-1)的熒光值變化繪制死亡細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線;通過對處理樣品的Hoechst/PI聯(lián)合染色的雙熒光吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算非壞死細(xì)胞數(shù)。所有計(jì)數(shù)均在96孔板上(NUNC)完成，37℃恒溫反應(yīng)30 min后測定。

1.6 氧化還原抑制劑對紫檀芪引起HeLa細(xì)胞凋亡的影響 選擇活性氧及GSH的相應(yīng)抑制劑與調(diào)節(jié)劑按照 CAT(2 ×105Units·L-1)、BSO(200 μmol·L-1)、NAC(200 μmol·L-1)、Temp(200 μmol·L-1)所標(biāo)示濃度加入HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基中，預(yù)處理2 h后加入紫檀芪80 μmol·L-1處理48 h測定凋亡率，空白對照為培養(yǎng)2 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h的HeLa細(xì)胞。

1.7 紫檀芪對細(xì)胞氧化還原態(tài)變化的影響 細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平的變化以細(xì)胞總活性氧及還原型谷胱甘肽的變化來表示。使用熒光探針(H2DCFDA)(Ex/Em=488 nm/525 nm)來檢測細(xì)胞內(nèi)總活性氧，CMFDA探針檢測還原型谷胱甘肽(Ex/Em=492 nm/517 nm)。收集經(jīng)不同濃度紫檀芪處理的HeLa細(xì)胞，使用終濃度20 μmol·L-1H2DCFDA 或5 μmol·L-1CMFDA 于 37℃ 孵育 30 min，2000 r·min-1離心收集細(xì)胞并用PBS洗掉未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光探針。無酚紅培養(yǎng)基重懸HeLa細(xì)胞，酶標(biāo)儀檢測熒光光度。MFI表示為每10 000個非壞死細(xì)胞對應(yīng)的熒光吸收。

1.8 紫檀芪對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫標(biāo)志分子的轉(zhuǎn)錄水平的影響 分別使用CAT(2×105Units·L-1)或NAC(200 μmol·L-1)預(yù)處理 HeLa細(xì)胞2 h后，加入紫檀芪80 μmol·L-1處理48 h。陽性對照培養(yǎng)2 h后加入DTTox(20 μmol·L-1)處理48 h。空白對照為培養(yǎng)2 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h的HeLa細(xì)胞。處理完畢后，所有處理同時測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)分子表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)使用相對半定量RT-PCR方法來檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫標(biāo)志分子grp78、CHOP的表達(dá)變化。使用TRIzol試劑盒提取總RNA。不同處理的細(xì)胞樣品RNA通過Revert Aid H Minus反轉(zhuǎn)錄試劑盒并使用Oligo(dT)18進(jìn)行cDNA第一鏈合成，42℃延伸60 min。PCR擴(kuò)增條件為:熱啟動，起始溫度 94℃，3 min;變性 94℃，30 s;復(fù)性 58℃，30 s;延伸72℃，45 s;為了使擴(kuò)增產(chǎn)物量與循環(huán)數(shù)保持在線性范圍內(nèi)，我們根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)定了以下引物及對應(yīng)反應(yīng)循環(huán)數(shù)(16-35)［6］。grp78，上游引物:5′-TAG CGT ATG GTG CTG CTG TC-3′，下游引物:5′-TTT GTC AGG GGT CTT TCA CC-3′，擴(kuò)增循環(huán)數(shù) 19;CHOP，上游引物:5′-AGC TGA GTC ATT GCC TTT CT-3′，下游引物:5′-CTG GTT CTC CCT TGG TCT TC-3′，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)32;內(nèi)標(biāo)β-actin，上游引物:5′-ATG ATA TCG CCG CGC TCG-3′，下游引物:5′-CGC TCG GTG AGG ATC TTC A-3′，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)35。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(1.2%)電泳后，使用SDNAClear核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件作t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 紫檀芪對HeLa細(xì)胞增殖的影響 不同濃度紫檀芪對HeLa細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用，這與處理時間和劑量成正相關(guān)(Fig 2)。紫檀芪濃度小于20 μmol·L-1時對HeLa細(xì)胞抑制率較低，當(dāng)濃度增加至40～80 μmol·L-1時細(xì)胞抑制率呈快速上升趨勢。紫檀芪作用48 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為 80 μmol·L-1。而經(jīng)過長時間(72 h)高濃度紫檀芪(120 μmol·L-1)處理，HeLa細(xì)胞近乎全部死亡。據(jù)此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇藥物濃度為80 μmol·L-1、處理時間為48 h進(jìn)行研究。

Fig 2 The inhibitory rate of Pte on HeLa cells after the treatment of 24，48 and 72 hoursHeLa cells were treated with 0 ～ 160 μmol·L-1pterostilbene for time intervials of 24，48 and 72 hours.The cytotoxcity of Pte on HeLa cell was made by SRB assay.The mean viability relative to control was plotted against the Pte concentration.An IC50of Pte on HeLa cells at 48 h is 80 μmol·L-1.The error bars represent the 95% confidence intervals of three independent experiments.

2.2 紫檀芪引起HeLa細(xì)胞凋亡 普通光鏡下正常對照組的HeLa細(xì)胞成簇平鋪分布，呈不規(guī)則菱形，細(xì)胞界限清晰(Fig 3A)。紫檀芪處理48 h后，HeLa細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)。細(xì)胞膜呈現(xiàn)囊泡化特殊結(jié)構(gòu)(Fig 3B，3F)。細(xì)胞核DNA經(jīng)Hochest熒光試劑染色后，空白對照組細(xì)胞核呈圓形(Fig 3C)，藥物處理組則表現(xiàn)出核凋亡所特有的不均一化形態(tài)(Fig 3D)。通過AO/EB雙染可以看出凋亡是紫檀芪引起HeLa細(xì)胞死亡的主要因素(Fig 3E，3F)。經(jīng)凝膠電泳分析，對照組HeLa細(xì)胞DNA沒有片段化，而80 μmol·L-1紫檀芪處理 HeLa細(xì)胞 48 h后DNA呈現(xiàn)梯狀片段化，120 μmol·L-1則更加明顯(Fig 3G)。

2.3 紫檀芪對HeLa細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變及在凋亡中的作用 為了研究紫檀芪引起HeLa細(xì)胞凋亡的原因，本實(shí)驗(yàn)測定了紫檀芪引起HeLa細(xì)胞活性氧與還原力(GSH)隨藥物濃度改變而變化的動態(tài)關(guān)系(Fig 4)。在紫檀芪濃度由5 μmol·L-1至160 μmol·L-1增加過程中，HeLa細(xì)胞內(nèi)活性氧含量也在增加，且當(dāng)紫檀芪濃度超過80 μmol·L-1后迅速升高。但細(xì)胞內(nèi)GSH含量在紫檀芪濃度低于80 μmol·L-1時，隨著 ROS 的升高而升高;而當(dāng)紫檀芪濃度超過80 μmol·L-1后，細(xì)胞內(nèi)GSH含量又迅速下降。為了研究GSH水平的劇烈變化是否影響到細(xì)胞的凋亡，我們使用了氧化還原反應(yīng)抑制劑來分析紫檀芪誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過程中對氧化還原態(tài)變化的影響。在氧化還原反應(yīng)抑制劑中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)特異性抑制劑BSO能夠引起細(xì)胞凋亡。抗氧化酶及底物過氧化氫酶CAT、GSH合成前體物NAC以及超氧陰離子淬滅劑Tempol均不引起HeLa細(xì)胞凋亡。在紫檀芪處理HeLa細(xì)胞前通過這些氧化還原抑制劑預(yù)處理，我們發(fā)現(xiàn)BSO預(yù)處理明顯升高了紫檀芪引起HeLa細(xì)胞的凋亡率，而CAT和NAC可以抑制紫檀芪所引起的HeLa細(xì)胞凋亡。但Tempol預(yù)處理對紫檀芪引起HeLa細(xì)胞凋亡影響并不明顯(Fig 5)。

Fig 3 Morphological characteristics of HeLa cells and fragmentation of genomic DNA of HeLa cells(magnified 200×)A，C，E:HeLa cells without Pte treatment.B，D，F(xiàn):HeLa cells treated with 80 μmol·L-1Pte for 48h.A and B were photoed by light microscopy to show the morphological changes of HeLa cells.C and D were photoed by fluorescence microscope to show the morphological changes of HeLa cell nucleus.E and F were photoed by fluorescence microscope in term of AO/EB stain to show the differences in apoptosis and necrosis of HeLa cells.G:DNA ladder of HeLa cells were observed after exposed to Pte for 48 h.The left lane:control sample without Pte treatment.The middle lane:sample treated by 80 μmol·L-1Pte.The right lane:sample treated by 120 μmol·L-1Pte.

Fig 4 ROS generation and GSH changes in HeLa cells induced by Pte(magnified 200×)

2.4 紫檀芪對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫標(biāo)志分子的轉(zhuǎn)錄水平的影響 如Fig 6所示，紫檀芪誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫是其凋亡的主要原因之一。隨著紫檀芪濃度增大，grp78及CHOP的表達(dá)量均相對于對照明顯增加，甚至超過陽性對照(DTTox)所引起的程度(Fig 6)。通過CAT及NAC共處理HeLa細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫分子grp78與CHOP表達(dá)量均明顯降低，這與Fig 5中二者能夠抑制紫檀芪引起的HeLa細(xì)胞凋亡現(xiàn)象一致。

3 討論

有關(guān)紫檀芪的抗腫瘤活性研究較少，僅有少數(shù)細(xì)胞毒活性研究證實(shí)其能夠抑制B16-F10細(xì)胞、HL-60細(xì)胞的生長［7］。紫檀芪對體外生長的B16-F10細(xì)胞的抑制率為40%(40 μmol·L-1)，對體內(nèi)實(shí)體瘤生長抑制率為52%。在前髓系白血病HL-60細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中，紫檀芪引起細(xì)胞凋亡的AC50為70 μmol·L-1，而白藜蘆醇的 AC50為 50 μmol·L-1。與HL-60細(xì)胞接近，在HeLa細(xì)胞上紫檀芪IC50為80 μmol·L-1。已知白藜蘆醇對多株腫瘤細(xì)胞的IC50范圍為(32 ～ 100 μmol·L-1)［7-8］。這些證據(jù)說明紫檀芪細(xì)胞毒活性較白藜蘆醇弱。

Fig 5 Effects of ROS scavengers，GSH modulator on Pte-induced apoptosis in HeLa cells for 48 hPte was used at 80 μmol·L-1.CAT(2 × 105Units·L-1);BSO(200 μmol· L-1);NAC(200 μmol· L-1);Temp(200 μmol·L-1);＊＊P＜0.01 vs the Blank(BLK);##P＜0.01 vs Pte.The results shown representative of three independent experiments(Student’s ttest).

Fig 6 Expression of grp78 and CHOP in different groups detected by semi-quantitative RT-PCRBlank(BLK)，DTT mean positive control of DTTox，CAT+Pte means Pte treatment(80 μmol·L-1)combined with catalase(2 × 105 Units·L-1)，NAC+Pte means Pte treatment(80 μmol·L-1)combined with NAC(200 μmol·L-1).

由于腫瘤細(xì)胞生長增殖依賴于細(xì)胞內(nèi)較高水平的活性氧，因此抗腫瘤藥物的研究多集中于細(xì)胞活性氧信號對凋亡調(diào)控的作用上［9］。近年來人們逐漸對一些抗氧化藥物的實(shí)際作用產(chǎn)生質(zhì)疑:一些非生物系統(tǒng)證實(shí)的抗氧化藥物在生物系統(tǒng)內(nèi)表現(xiàn)為助氧化［1］。目前尚沒有足夠的證據(jù)證明紫檀芪的氧化/還原性。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)紫檀芪引起HeLa細(xì)胞活性氧升高時，GSH也在一定范圍內(nèi)的增加。這表明經(jīng)紫檀芪處理后，HeLa細(xì)胞能在一定程度維持胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定，此過程可能與細(xì)胞抗氧化應(yīng)答元件的如Nrf-2/ARE調(diào)控有關(guān)［10］。如果不考慮熒光探針的檢測效率，從數(shù)量級上我們可以看出HeLa細(xì)胞內(nèi)GSH的主導(dǎo)地位，這與其它的報(bào)道是一致的［11］。谷胱甘肽是細(xì)胞中所有還原物質(zhì)中含量最高的(約1～10 mmol·L-1)，其變化可能對細(xì)胞正常生長具有較大的影響。細(xì)胞質(zhì)中GSSG∶GSH約為1∶100，而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，GSSG∶GSH約為1∶3。這使得當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)受到藥物影響而改變時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對GSH的變化表現(xiàn)尤為敏感［12］。同時也提示了當(dāng)紫檀芪濃度超過80 μmol·L-1后細(xì)胞的凋亡率迅速升高的原因。紫檀芪引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫分子grp78與CHOP表達(dá)量增加，說明在凋亡過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)。而通過CAT和NAC來抑制細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生并促進(jìn)GSH的生成時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志分子表達(dá)減弱。這說明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在紫檀芪誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過程中可能擔(dān)當(dāng)了重要的角色。當(dāng)通過這些抗氧化劑進(jìn)行預(yù)處理時，清除細(xì)胞內(nèi)H2O2或增加GSH的含量均可抑制凋亡的產(chǎn)生，而清除O-·2卻不能抑制凋亡，進(jìn)一步說明細(xì)胞內(nèi)H2O2/GSH的失衡可能在紫檀芪誘導(dǎo)凋亡過程中承擔(dān)重要角色。

綜上所述，紫檀芪能抑制HeLa細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。紫檀芪通過影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)進(jìn)而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。本研究直接將細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平變化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑聯(lián)系起來，并探討了紫檀芪誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制，為腫瘤的治療及新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

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