除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎及胚后發(fā)育的毒性作用

劉 偉,趙 艷,邊邵康,趙春盛,王麗文

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院,中國(guó) 錦州 121001;2.沈陽(yáng)師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó) 沈陽(yáng) 110034)

丁草胺[2-氯-N-(2.6-二乙基笨基)-N-(丁癢甲基)乙酰胺]，是一類酰胺類除草劑，因其具有高效、低毒、價(jià)廉等特點(diǎn)而被廣泛地應(yīng)用于各水稻田中[1]．除草劑的應(yīng)用，極大地減少了勞動(dòng)強(qiáng)度，直接或間接地提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平．由于除草劑多為有一定殘效期的化合物，且可在生物體內(nèi)富集，因此其對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響已引起世界各國(guó)的重視．兩棲動(dòng)物因其自身皮膚裸露、滲透性強(qiáng)的生理和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，極易受到環(huán)境的影響，是一類水環(huán)境質(zhì)量的指示生物[2]．目前，兩棲類種群在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出衰退的趨勢(shì)，除草劑等農(nóng)藥的大量使用可能是造成環(huán)境污染，引起兩棲類種群衰退的主要原因之一[1,3]．

中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)，俗稱哈士蟆，隸屬于兩棲綱，無(wú)尾目，蛙科，林蛙屬．是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)蛙類，是一種集藥用、食補(bǔ)、美容三種兼容的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，被譽(yù)為深山老林珍品、滋補(bǔ)健身極品．本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎及胚后發(fā)育的影響以及林蛙胚胎對(duì)丁草胺的耐受性的研究，探討除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎及胚后發(fā)育的毒性作用以及對(duì)環(huán)境、人類可能造成的潛在毒害，為除草劑的安全、合理使用，為林蛙的養(yǎng)殖提供可靠的科學(xué)依據(jù)．

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的中國(guó)林蛙胚胎取自遼寧省岫巖地區(qū)，早期胚胎為自然產(chǎn)出的，發(fā)育時(shí)期大多處于囊胚期；胚后發(fā)育所用蝌蚪為實(shí)驗(yàn)室自然孵化．實(shí)驗(yàn)所用的水是曝氣后的自來(lái)水；實(shí)驗(yàn)溫度是在室溫下(22±2) ℃進(jìn)行的；除草劑丁草胺由大連孟山都公司制造，為體積分?jǐn)?shù)為60%的丁草胺乳油．

1.2 方法

1.2.1 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎發(fā)育的毒性作用 根據(jù)除草劑丁草胺在稻田中施用的濃度將除草劑分別配制成稻田組、稻田2倍組和稻田3倍組3種試驗(yàn)用液，其濃度分別為3,6,9 mg/L．將中國(guó)林蛙受精卵(囊胚期)隨機(jī)分成4組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組為130枚，分別放入盛有曝氣的自來(lái)水和試驗(yàn)用液的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿中放65枚．各濃度溶液為30 mL．為保證藥液的濃度和水中的氧含量，24 h更換試驗(yàn)用液一次．在連續(xù)變倍雙目體視解剖鏡下連續(xù)觀察受精卵的變化過(guò)程，記錄其發(fā)育各個(gè)時(shí)期持續(xù)的時(shí)間及測(cè)量胚體長(zhǎng)度．胚胎發(fā)育的分期標(biāo)準(zhǔn)以陳偉庭、李東風(fēng)等人[4]的報(bào)告為依據(jù)．

1.2.2 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚后發(fā)育的毒性作用 根據(jù)鄭曉晶的壬基酚對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪的急性毒性和雌激素效應(yīng)[5]中的方法，將孵化出的林蛙蝌蚪隨機(jī)分為4組，每組30只，分別放入盛有曝氣的自來(lái)水和試驗(yàn)用液的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿中放蝌蚪10只，觀察中國(guó)林蛙蝌蚪暴露在0.17,0.20,0.24 mg/L濃度的除草劑丁草胺中24,48,96 h的致死、致畸及滯育效應(yīng)(每個(gè)時(shí)間各觀察10只)．各濃度溶液仍均為30 mL，為保證藥液的濃度和水中的氧含量，每24 h更換藥液一次．

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Excel統(tǒng)計(jì)分析并作圖，以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示, 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異用t檢驗(yàn)比較分析．

2 結(jié)果2.1 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎發(fā)育的毒性作用

2.1.1 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎發(fā)育時(shí)間的毒性作用 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎發(fā)育時(shí)間的毒性作用見(jiàn)圖1．圖1表明除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎發(fā)育時(shí)間的毒性作用較小．在原腸期隨著丁草胺濃度的增加，發(fā)育時(shí)間縮短；而到了尾芽期和肌肉效應(yīng)期時(shí)，隨著丁草胺濃度的增加，發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)；在胚胎最后的出膜期，胚胎發(fā)育速度加快，但差異均不顯著(P>0.05)．對(duì)照組中國(guó)林蛙胚胎從囊胚期發(fā)育到脫膜期歷時(shí)73.9 h，而染毒組發(fā)育時(shí)間分別為74.0,74.4,73.6 h，差異不顯著(P>0.05)．

2.1.2 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚體長(zhǎng)度的毒性作用 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚體長(zhǎng)度的毒性作用見(jiàn)圖2．除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙的胚體長(zhǎng)度的毒性作用與對(duì)發(fā)育時(shí)間的毒性作用相似．在尾芽期、肌肉感應(yīng)期和出膜期胚體長(zhǎng)度減小，但差異均不顯著(P>0.05)．

2.2 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚后發(fā)育的毒性作用

除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚后發(fā)育的毒性作用見(jiàn)表1、表2和圖3．由表1可以看出，除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚后發(fā)育具有明顯的致死、致畸和滯育效應(yīng)．丁草胺濃度為0.17 mg/L在24 h時(shí)出現(xiàn)死亡2只，濃度為0.24 mg/L在48 h和96 h各死亡1只，濃度為0.20 mg/L時(shí)沒(méi)有死亡．除草劑丁草胺對(duì)林蛙胚后發(fā)育具有明顯的滯育效應(yīng)，且隨著染毒濃度和染毒時(shí)間的增加而加大．表1中可以看出，蝌蚪的滯育數(shù)量在丁草胺濃度為0.17 mg/L 24 h時(shí)無(wú)滯育發(fā)生；而丁草胺濃度為0.20 mg/L和0.24 mg/L時(shí)，在3個(gè)時(shí)間段都出現(xiàn)了6只和5只的滯育蝌蚪．且在染毒24 h和48 h，蝌蚪滯育和染毒濃度的劑量關(guān)系較為明顯，而在染毒96 h，各濃度的滯育效應(yīng)基本一致(見(jiàn)表2)．

1囊胚期 2原腸期 3神經(jīng)板期 4神經(jīng)褶期 5神經(jīng)管期 1囊胚期 2原腸期 3神經(jīng)板期 4神經(jīng)褶期 5神經(jīng)管期6尾芽期 7肌肉效應(yīng)期 8心跳期 9 鰓血循環(huán)期 10脫膜期 6尾芽期 7肌肉效應(yīng)期 8心跳期 9 鰓血循環(huán)期 10脫膜期圖1 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎發(fā)育時(shí)間的影響 圖2 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚體長(zhǎng)度的影響

丁草胺濃度/(mg·L-1)胚胎總數(shù)24 h48 h96 h正常胚胎死亡胚胎滯育胚胎畸形胚胎正常胚胎死亡胚胎滯育胚胎畸形胚胎正常胚胎死亡胚胎滯育胚胎畸形胚胎對(duì)照組3010000901090100.17305203502340330.20304060406140630.2430505051414153

注：表中死亡滯育畸形等胚胎的數(shù)目總和大于10，是因?yàn)橛行┡咛ゼ葴只?

表2 除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚后發(fā)育滯育的影響 mm

除草劑丁草胺致中國(guó)林蛙胚胎畸形的主要形式見(jiàn)圖3．脊椎彎曲：胚體的脊椎不是位于一條直線上，尾部向一側(cè)彎曲；尾部畸形：尾巴沒(méi)有明顯的形狀或彎曲短小，大部分尾部畸形與其他的畸形效應(yīng)同時(shí)出現(xiàn)；腹部畸形：腹部腫大積水，并出現(xiàn)器官消失狀態(tài)持續(xù)一定時(shí)間胚胎死亡；體形不規(guī)則．

A.脊椎彎曲 B.腹部腫大尾巴短小 C.腹部畸形(充水) D.尾巴彎曲腹部腫脹 E.體形不規(guī)則(頭部) F.正常蝌蚪圖3 畸形胚胎的各種形態(tài)

3 討論

除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎發(fā)育的時(shí)間和胚體長(zhǎng)度的毒性作用可能和除草劑在體內(nèi)的富集有關(guān)，與除草劑在魚(yú)類體內(nèi)的富集相似[6]．酰胺類除草劑主要通過(guò)雜草幼芽和幼根所吸收，在雜草內(nèi)進(jìn)行運(yùn)輸，抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成而使雜草死亡[7]．尾芽期和肌肉效應(yīng)期是胚體生長(zhǎng)速度最快、發(fā)育時(shí)間較長(zhǎng)的時(shí)期，隨著丁草胺濃度的增加和染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，丁草胺在胚胎的富集而抑制了胚胎蛋白質(zhì)的合成，從而使胚胎發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)，胚體縮短．而除草劑丁草胺使原腸期和出膜期的胚胎發(fā)育時(shí)間縮短，可能與原腸期發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)，丁草胺在胚胎早期的富集和脫膜期卵膠囊的破壞，導(dǎo)致丁草胺的大量進(jìn)入而產(chǎn)生的應(yīng)激效應(yīng)有關(guān)．但除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎發(fā)育的時(shí)間和胚體長(zhǎng)度的毒性作用均較小，且無(wú)顯著差異，這與楊曉梅等用乙草胺處理中華大蟾蜍早期胚胎得到的結(jié)果相似[8]，可能與中國(guó)林蛙受精卵的卵膠囊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及耐受程度起保護(hù)作用有關(guān)．林蛙的卵膠膜內(nèi)外兩層清晰可分辨，膠膜的主要成分是粘多糖(酸性和中性)、一些單糖、蛋白質(zhì)和唾液酸等物質(zhì)．多種兩棲動(dòng)物膠膜中還含有特異性組成成分和許多不同的抗原，這些結(jié)構(gòu)使膠膜可保護(hù)受精卵不受機(jī)械刺激和外來(lái)有害物質(zhì)的影響．當(dāng)發(fā)育到出膜期，由于沒(méi)有卵膠囊的保護(hù)作用，胚胎對(duì)除草劑丁草胺的耐受性大大降低，導(dǎo)致胚胎大量死亡．中國(guó)林蛙胚胎從囊胚期發(fā)育到脫膜期的發(fā)育時(shí)間變化不大，與李東風(fēng)、陳偉庭的中國(guó)林蛙早期胚胎發(fā)育中計(jì)算從囊胚期到出膜期的72.5 h基本相同[4]．

除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚后發(fā)育的毒性作用明顯強(qiáng)于胚胎發(fā)育．濃度較正常稻田使用低得多的丁草胺就對(duì)中國(guó)林蛙胚后發(fā)育具有明顯的致死、致畸和滯育效應(yīng)．各種畸形與侯立靜等研究丙線磷對(duì)中華大蟾蜍早期胚胎發(fā)育的影響的畸形效應(yīng)基本一致[3]．這可能是由于缺少了卵膠囊的保護(hù)作用，除草劑丁草胺等化學(xué)因子通過(guò)滲透作用而直接影響中國(guó)林蛙的蝌蚪，使其正常新陳代謝功能和特定的蛋白質(zhì)合成及基因表達(dá)過(guò)程遭到抑制．

作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除草劑丁草胺對(duì)中國(guó)林蛙胚胎發(fā)育的毒性較小，而對(duì)出膜后的蝌蚪具有較強(qiáng)的毒性作用，較低濃度的除草劑就會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的致死、致畸和滯育效應(yīng)．因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，在一定程度上限制除草劑等有害農(nóng)藥的使用對(duì)于兩棲動(dòng)物的保護(hù)是十分必要的．

參考文獻(xiàn)：

[1] 姚 斌，徐建民，張超蘭.除草劑丁草胺的環(huán)境行為綜述[J].生態(tài)環(huán)境, 2003,12(1)：66-69.

[2] 儲(chǔ)昭霞，席貽龍，徐曉平,等. 除草劑草甘膦對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)生活史特征的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2005,(6)：1 142-1 145.

[3] 侯立靜，楊曉梅,馬 躍，等.丙線磷對(duì)中華大蟾蜍早期胚胎發(fā)育的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2005,24(4)：682-685.

[4] 陳偉庭，李東風(fēng).中國(guó)林蛙早期胚胎發(fā)育觀察[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2005,(3)：40-45.

[5] 鄭曉晶.壬基酚對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪生長(zhǎng)發(fā)育的毒性效應(yīng)[J].生態(tài)學(xué)雜志, 2008,(8)：1 332-1 336.

[6] RIBAS G, CARBONELL E, CREUS A,etal. Genotoxity of humic acid in cultured human lymphocytes and its interaction with the herbicides alachlor and maleic hydrazide[J].Environ Molec Mut, 1997,29(3)：272-276.

[7] 何 林，鄧新平，王進(jìn)軍,等.幾種酰胺類除草劑毒力、藥效及安全性評(píng)價(jià)[J].農(nóng)藥,2002,41(12)：36-38.

[8] 楊曉梅,譚志軍，苑 怡，等.乙草胺對(duì)中華大蟾蜍早期胚胎發(fā)育的影響[J].動(dòng)物學(xué)報(bào), 2001,47(S1)：25-30.