轉(zhuǎn)染杜氏鹽藻 14-3-3基因?qū)κ彻荀[癌 EC9706細(xì)胞 Bcl-2和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響＊

魏 攀,李 杰,王莉莉,許培榮,薛樂勛

鄭州大學(xué)生物系細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450001

#通訊作者,男,1944年生,本科,教授,研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程,E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

W EI Pan,L I Jie,WANG Lili,XU Peirong,XUE Lexun

Laboratory for Cell B iology,Departm ent of B iology,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

轉(zhuǎn)染杜氏鹽藻 14-3-3基因?qū)κ彻荀[癌 EC9706細(xì)胞 Bcl-2和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響＊

魏 攀,李 杰,王莉莉,許培榮,薛樂勛#

鄭州大學(xué)生物系細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450001

#通訊作者,男,1944年生,本科,教授,研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程,E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻;14-3-3基因;食管鱗癌;Bcl-2;Caspase-9

目的:探討轉(zhuǎn)染杜氏鹽藻 14-3-3基因?qū)κ彻荀[癌 EC9709細(xì)胞 Bcl-2和 Caspase-9蛋白表達(dá)的影響。方法:將杜氏鹽藻 14-3-3基因 cDNA序列分別亞克隆入表達(dá)載體 pEGFP-C1和 pcDNA3.1(+)的 HindⅢ和 BamHⅠ位點,構(gòu)建真核表達(dá)載體 pEGFP-C1-14-3-3和 pcDNA3.1(+)-14-3-3,采用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染 EC9706細(xì)胞,同時設(shè)立空載體對照和空白對照,熒光顯微鏡觀察 pEGFP-14-3-3融合蛋白在 EC9709細(xì)胞中的定位;G-418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的細(xì)胞株,采用 RT-PCR和Western blotting法檢測 14-3-3基因的表達(dá);Western blotting檢測 3種細(xì)胞中 Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果:pEGFP-14-3-3融合蛋白定位于 EC9706細(xì)胞的細(xì)胞核;通過 G-418篩選,最終獲得穩(wěn)定表達(dá)鹽藻 14-3-3基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;與轉(zhuǎn)染空載體和空白對照的 EC9706細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的 EC9706細(xì)胞中 Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯增高 [(1.60±0.20)、(0.90±0.15)和 (2.40±0.10);F=69.889 7,P<0.001],而 Caspase-9蛋白表達(dá)量明顯降低 [(1.00±0.04)、(1.40±0.08)和 (0.40±0.05);F=217.066 7,P<0.001]。結(jié)論:杜氏鹽藻 14-3-3基因可能在 EC9706細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了抑制作用。

W EI Pan,L I Jie,WANG Lili,XU Peirong,XUE Lexun

Laboratory for Cell B iology,Departm ent of B iology,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

14-3-3蛋白是一種纖毛相關(guān)蛋白,可與癌基因或原癌基因產(chǎn)物結(jié)合參與細(xì)胞信號傳導(dǎo),通過與極性蛋白 CRB3結(jié)合,維持極性蛋白的正確定位和纖毛的正常組裝[1-2]。有研究[3]報道,參與纖毛 /鞭毛組裝和調(diào)控的基因異常能引起許多人類遺傳性疾病,但其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系目前還不清楚。關(guān)于纖毛組裝和調(diào)控的研究主要依賴于單細(xì)胞真核生物,鞭毛內(nèi)運輸機制最早在雙鞭毛衣藻中得到證實[4]。杜氏鹽藻細(xì)胞與衣藻細(xì)胞相比在結(jié)構(gòu)上無細(xì)胞壁,同時還具有一對等長的鞭毛,具有典型的 9+2結(jié)構(gòu)。以上特點使杜氏鹽藻鞭毛有望成為研究人類纖毛疾病的模式細(xì)胞器。課題組最近克隆了杜氏鹽藻鞭毛相關(guān)基因 14-3-3 cDNA全長序列,蛋白 BLAST結(jié)果顯示與人類相應(yīng)蛋白同源性高達(dá) 80%[5-6]。作者將杜氏鹽藻 14-3-3基因轉(zhuǎn)染食管鱗癌 EC9706細(xì)胞株,觀察其在細(xì)胞中的定位以及其對 EC9706細(xì)胞中 Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 杜氏鹽藻 (LB1644,Dunaliella salina,美國德州大學(xué)),食管鱗癌 EC9706細(xì)胞株 (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室惠贈),pEGFP-C1和 pcDNA3.1(+)載體 (大連寶生物工程公司),PCR引物 (上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成),RPM I 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶 (美國 Hyclone公司),β-actin多克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體和 Caspase-9多克隆抗體 (美國Santa Cruz公司 )。

1.2 方法

1.2.1 杜氏鹽藻 14-3-3基因的擴增 根據(jù) Genbank登錄序列 (Genbank登錄號:AY965896)設(shè)計引物:上游引物,5’-CAATAAGCTTATGCATCA TCATCATCATCATGCTGAGGCGAGAGAGGAGTG-3’(帶有HindⅢ酶切位點和6個組氨酸標(biāo)簽);下游引物, 5 ’-GCCCGGATCCTTAGGCATCGGCCTCCTC AACCTT-3’(帶有B amHⅠ酶切位點),擴增產(chǎn)物大小 774 bp。以杜氏鹽藻 cDNA為模板進行 PCR擴增,反應(yīng)條件:95℃3 min;94℃30 s,54℃40 s,72℃1 min,30個循環(huán);72℃5 min;4℃保存。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR結(jié)果。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定pEGFP-C1、pcDNA3.1(+)和鹽藻 14-3-3基因目的片段同時用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切,純化酶切產(chǎn)物,將酶切后目的片段和載體片段以 3:1(物質(zhì)的量的比)連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 JM109后,挑選單個菌落并提取重組質(zhì)粒,HindⅢ和 BamHⅠ雙酶切鑒定,并送上海生工生物工程有限公司測序,鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒分別命名為 pEGFP2C12142323和 pcDNA3.1(+)2142323。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用含體積分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清的 RPM I1640培養(yǎng)基于 37℃、體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng) EC9706細(xì)胞,達(dá)到 90%～95%融合時,采用 Lipofectami2 neTM2000按說明書分別轉(zhuǎn)染 pEGFP2C12142323和pcDNA3.1(+)2142323,同時設(shè)空載體對照和空白對照。

1.2.4 pEGFP2142323融合蛋白定位的熒光顯微鏡觀察 轉(zhuǎn)染 EC9706細(xì)胞 24 h后,用顯微熒光攝像 /照相系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 pEGFP2142323融合蛋白的表達(dá),以藍(lán)光激發(fā),高倍鏡 (×400)下觀察。

1.2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)2142323細(xì)胞株的篩選和鑒定 將已轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)2142323的EC9706細(xì)胞用 G2418(400 mg/L)加壓篩選。每隔 2 d換液 1次,G2418含量不變,維持 3～4周。應(yīng)用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總 RNA,取 2μg總 RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴增鹽藻 142323,以β2actin為內(nèi)參,每組各設(shè) 3個復(fù)孔。鹽藻 142323引物序列同1.2.1;β2actin上游引物:5’2GGGACCTGACTGACTACCT2 CA23’,下游引物:5’2GACTCGTCATACTCCTGCTTG2 3’。反應(yīng)條件:95℃3 min;94℃30 s,54℃40 s,72℃1 min,30個循環(huán);72℃5 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng) 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)攝像,Bandscan 5.0軟件進行灰度分析。用蛋白裂解液提取 3組細(xì)胞的總蛋白,用 Bradford法測定蛋白濃度。制備十二烷基硫酸鈉 (SDS)2聚丙烯酰胺凝膠,每孔上樣量 60μg,常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,用鼠抗組氨酸標(biāo)簽 (His tag)的抗體作為一抗 (1:200),山羊抗小鼠 IgG抗體作為二抗 (1:10 000)進行Western blotting分析,同時用β2actin作陽性對照。ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光 X線膠片,應(yīng)用 TotalLab 2.0軟件進行圖像的灰度分析。

1.2.6 Bcl22和 Caspase29蛋白表達(dá)的Western blot2 ting分析 用蛋白裂解液提取 pcDNA3.1(+)214232 3轉(zhuǎn)染、pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染和不轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞的總蛋白,用 Bradford法測定蛋白濃度,方法同 1.2.5,Western blotting法分析目的蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析,轉(zhuǎn)染后 3組 EC9706細(xì)胞 Bcl22和 Caspase29蛋白表達(dá)的比較應(yīng)用單因素方差分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻 142323基因的擴增 PCR擴增出的DNA特異條帶片段大小約為 774 bp,與預(yù)期結(jié)果相符 (圖 1)。

圖1 杜氏鹽藻 142323基因 PCR擴增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 經(jīng) HindⅢ和 B amHⅠ雙酶切鑒定及測序分析,重組質(zhì)粒含有大小、方向和讀碼框均正確的插入片段 (圖 2)。

圖2 重組載體雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 EC9706細(xì)胞中 pEGFP2C12142323的定位高倍鏡下 (×400)可見轉(zhuǎn)染 pEGFP2C1空載體的EC9706細(xì)胞綠色熒光主要分布于胞質(zhì),胞核處可見圓形的空泡 (圖 3A)。轉(zhuǎn)染 EGFP2C12142323載體的EC9706細(xì)胞綠色熒光主要分布于胞核,可見明顯的核仁分裂相 (圖 3B)。

2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)2142323細(xì)胞株的篩選及鑒定結(jié)果 RT2PCR結(jié)果顯示 (圖 4),只有pcDNA3.1(+)2142323轉(zhuǎn)染株中擴增出鹽藻 142323基因片段,證明鹽藻 142323基因已成功轉(zhuǎn)入 EC9706細(xì)胞。Western blotting結(jié)果顯示 pcDNA3.1(+)-14-3-3轉(zhuǎn)染株在 25 000～32 000處有特異條帶,證明 14-3-3蛋白已經(jīng)表達(dá) (圖 5)。

2.5 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的 EC9706細(xì)胞Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表達(dá) 見表 1和圖 6。

表1 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的 EC9706細(xì)胞 Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表達(dá)

圖6 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-14-3-3的EC9706細(xì)胞Bcl-2和 Caspase-9蛋白的表達(dá)

3 討論

食管癌是世界上常見的惡性腫瘤之一,在食管發(fā)生囊性變或癌變時,可見有大量的纖毛突出于細(xì)胞表面,而纖毛作為諸多信號傳導(dǎo)的指令艙,在腫瘤發(fā)生中可能起重要作用[7]。衣藻和人的蛋白組學(xué)研究顯示14-3-3蛋白是一類纖毛/鞭毛相關(guān)蛋白[8-9],并且Fan等[2]的研究結(jié)果也提示其定位在纖毛。作者觀察到pEGFP-14-3-3融合蛋白主要在EC9706細(xì)胞的胞核部分表達(dá),其原因可能是由于哺乳類動物細(xì)胞株在體外傳代培養(yǎng)時,經(jīng)常會引起纖毛的丟失或形成初生纖毛,而細(xì)胞核是細(xì)胞的控制中心,在纖毛 /鞭毛的生成過程中具有生發(fā)點的作用。

研究[10]表明,14-3-3蛋白是細(xì)胞內(nèi)的一個重要抗凋亡因子,它能與Bcl-2蛋白家族中的一個促細(xì)胞凋亡成員Bad以磷酸絲氨酸依賴性的方式相互作用,從而拮抗Bad促細(xì)胞凋亡性質(zhì),抑制細(xì)胞凋亡。Caspase家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶家族,Caspase-9作為其中一員,屬于該家族的凋亡起始組,其活化可以激活凋亡效應(yīng)組的Caspase-3和Caspase-7,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而Caspase-3和Caspase-9之間存在正反饋效應(yīng),可使細(xì)胞凋亡加速。有研究[11]表明杜氏鹽藻14-3-3蛋白與細(xì)胞周期相關(guān),是一種細(xì)胞周期依賴蛋白。作者觀察到,與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體的細(xì)胞株相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-14-3-3的 EC9706細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增加,而Caspase-9蛋白的表達(dá)明顯降低,提示杜氏鹽藻14-3-3基因在可抑制 EC9706細(xì)胞的凋亡,從而為食管鱗癌的分子治療尋找到一個潛在的特定治療靶點——利用14-3-3拮抗劑結(jié)合RNA干擾技術(shù),通過降低14-3-3蛋白的表達(dá)水平,促進細(xì)胞的凋亡,可能為惡性腫瘤的治療提供新的策略;同時也為開發(fā)靶向分子藥物,改進食管鱗癌的治療方法及改善食管鱗癌患者的預(yù)后,提供了可行性。

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Expression of Bcl-2 and Caspase-9 proteins of EC9706 cell transfected 14-3-3 gene ofDunaliella salina

Dunaliella salina;14-3-3 gene;esophageal squamous cell cancer;Bcl-2;Caspase-9

A im:To investigate the effect of the 14-3-3 gene ofDunaliella salinaon the expression of Bcl-2 and Caspase-9 proteins of esophageal squamous cell cancer cell line EC9706.Methods:The cDNA fragment of the 14-3-3 gene ofDunaliella salinawas subcloned into theHindⅢ-BamHⅠsites of the eukaryotic expression vector pEGFP-C1 and pcDNA3.1(+),respectively,generating recombinant expression vectors pEGFP-C1-14-3-3 and pcDNA3.1(+)-14-3-3.The recombinant vectorswere transfected into EC9706 cells byLipofectamineTM2000 at the same time,the vectorswithout 14-3-3 genes served as controls,the location of the fusion EGFP-14-3-3 proteins was determined by fluorescent microscope and the EC9706 cells transfected with pcDNA3.1(+)-14-3-3 were selected with G-418 and characterized by RT-PCR and Western blotting,then the expression of the Bcl-2 and Caspase-9 proteins in the transfectants was monitored by Western blotting.Results:pEGFP-14-3-3 fusion proteins were localized in the nucleus of EC9706 cells.EC9706 cells stably expressing the 14-3-3 gene ofDunaliella salinawere obtained with G-418 selection.The expression of Bcl-2 protein significantly increased[(1.60±0.20),(0.90±0.15)and(2.40±0.10);F=69.889 7,P<0.001]while that of Caspase-9 protein decreased[(1.00±0.04),(1.40±0.08)and(0.40±0.05);F=217.066 7,P<0.001]in the EC9706 cells transfected with pcDNA3.1(+)-14-3-3,compared with the control groups.Conclusion:The introduction of the 14-3-3 gene ofDunaliella salinaupregulates the expression of Bcl-2 protein while downregulates that of Caspase-9 protein in the EC9706 cells,suggesting its potential role in inhibiting the apoptosis of cells.

Q789

＊國家自然科學(xué)基金資助項目 30700014;科技部國際科技合作基金資助項目 2007DFA01240

(2008-12-31收稿 責(zé)任編輯 趙秋民)