抗人參皂苷 Rg3抗血清的制備

曾華金,楊 冉,劉吉華,屈凌波,余伯陽#

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)化學(xué)系鄭州 450001 3)中國藥科大學(xué)中藥復(fù)方教研室南京 210038 4)河南工業(yè)大學(xué)鄭州 450001

(2008-12-15收稿 責(zé)任編輯 徐春燕)

人參是我國珍貴的傳統(tǒng)中藥,具有滋補、強壯及抗疲勞等多方面的藥理和生物活性。人參皂苷屬于三萜類皂苷,是其主要活性成分。研究[1-2]顯示,人參皂苷具有很強的抗單純皰疹病毒的活性及抑制腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的作用,但對腫瘤細胞本身并無細胞毒效應(yīng)。作者通過構(gòu)建人工抗原制備抗人參皂苷Rg3的特異性抗血清,為 Rg3的測定及藥代動力學(xué)的免疫學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器與試劑 免疫實驗動物為新西蘭大白兔 2只,體質(zhì)量約 2.5 kg,購于南京市金陵種兔場。透析袋(截取物質(zhì)相對分子質(zhì)量 8 000～10 000),紅外分光光譜儀 (Shimadzu,Japan),F-4500熒光光譜儀(Hitachi,Japan),酶標儀(Tecan,Austria)。Rg3購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院有機化學(xué)研究室 ,人參皂苷 Rg1、Rb1、Rg2、Compound K和Rh1均為自制,牛血清白蛋白(BSA,Amresco公司),卵清蛋白(OVA,Sigma公司),三硝基苯磺酸(TNBS,Sigma公司),高碘酸鈉(NaIO4,廣東西隴化工廠),硼氫化鈉(NaBH4,中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司),羊抗兔辣根過氧化物酶(IgG-HRP,武漢博士德生物工程有限公司),福氏完全佐劑(FCA,上海思吉生物制品有限公司),福氏不完全佐劑(FIA,自制),其他試劑為分析純。

1.2 人工抗原 Rg3-BSA的制備 參照文獻[3],采用高碘酸鹽氧化法將 Rg3與 BSA和 OVA共價偶聯(lián),分別合成免疫抗原 Rg3-BSA和包被抗原 Rg3-OVA。

1.3 人工抗原的鑒定及偶聯(lián)率的測定 參考文獻[4],用溴化鉀將 Rg3、BSA及透析后的 Rg3-BSA制成薄片進行紅外光譜鑒定。在 BSA熒光光譜最大激發(fā)波長 280 nm的激發(fā)下,對適當濃度的 Rg3、BSA、Rg3-BSA及 2者混合物(Rg3+BSA)進行熒光光譜分析。采用 TNBS法[5]測定 Rg3-BSA的偶聯(lián)率,偶聯(lián)率 =[DBSA(335 nm)-DRg3-BSA(335 nm)/DBSA(335 nm)]×100%×60。

1.4 抗血清的制備 免疫動物為 2只新西蘭大白兔,第 1次基礎(chǔ)免疫時,取 1 mL人工抗原 Rg3-BSA(含 1 mg的 Rg3-BSA),同時加入等體積的 FCA,用注射器來回抽拉制成乳劑。以背部多點注射法進行免疫,注射 20個點,每個點 100μL。以后每間隔 10 d加強免疫 1次,免疫量為初始劑量的 1/2,與等體積的 FIA制成乳劑,共加強免疫注射 5次。最后 1次免疫注射量為 1 mL抗原(含 1 mg的 Rg3-BSA)與等體積 FIA制成乳劑,免疫注射 7 d后,于頸動脈取全血,室溫放置 1 h后轉(zhuǎn)至 4℃過夜,然后 4 000 r/min離心 10 min,所得抗血清于 -70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 抗血清的鑒定 用方陣滴定的方法優(yōu)化包被抗原和抗血清的工作濃度[6]。確定理想的包被抗原濃度后,采用間接 ELISA法測定抗體的效價。取1只兔子產(chǎn)生的抗血清進行抗血清特異性交叉反應(yīng)實驗。選擇人參皂苷 Rb1、Rg2、Rh1、Rg1和 Compound K進行競爭性抑制實驗,根據(jù)公式計算各自的 IC50值及交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工抗原 Rg3-BSA的鑒定 紅外光譜鑒定結(jié)果見圖 1。比較 Rg3-BSA與 Rg3的紅外光譜發(fā)現(xiàn),Rg3-BSA在 3 400 cm-1附近出現(xiàn) Rg3羥基的特征峰,這與 BSA的紅外光譜存在差異,證明偶聯(lián)成功,Rg3-BSA可以用作免疫抗原。熒光光譜鑒定結(jié)果見圖 2。Rg3-BSA熒光光譜的最大發(fā)射波長相對于BSA發(fā)生了明顯的藍移,提示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[7],因此說明蛋白質(zhì)所發(fā)生的改變是由于 BSA與 Rg3分子相互結(jié)合生成了新的物質(zhì)(Rg3-BSA)。Rg3-BSA的偶聯(lián)率為 28,相對分子質(zhì)量為 90 400。

2.2 抗血清的制備與鑒定 采用方陣滴定法,確定理想的包被抗原濃度和抗血清的工作濃度分別為1 000μg/L和 1:20 000。以免疫前血清為陰性對照,測得 2只兔子產(chǎn)生的抗血清的效價均為 1:51 200,見圖 3。抗血清交叉反應(yīng)率見表 1?？梢钥闯?所制備的抗血清與其他人參皂苷的交叉反應(yīng)率很低,小于 3%,說明抗血清的特異性強。經(jīng)計算得到 Rg3的 IC50值為 2.91μg/L,表明 ELISA方法具有較高的靈敏度,適合用于人參皂苷 Rg3的微量測定與分析研究。

表 1 抗血清交叉反應(yīng)率

[1]劉繼華,盧丹,劉金平,等.20S-人參皂苷 Rg3眼膏在兔眼組織分布及其藥代動力學(xué)[J].藥學(xué)學(xué)報,2005,40(3):258

[2]王兵,王杰軍,徐鈞,等.人參皂苷 Rg3對胃癌誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用[J].腫瘤防治雜志,2001,8(3):234

[3]徐玲,王冕,劉新彥,等.分光光度法測定參皇霜中人參皂苷Re的含量[J].中國新醫(yī)藥,2003,2(5):96

[4]曾華金,劉吉華,余伯陽.抗甘草酸二銨抗血清的制備[J].免疫學(xué)雜志,2006,22(5):570

[5]Habeeb AF.Determination of free aminogroups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid[J].Anal Biochem,1966,14(3):328

[6]李宗霆,周燮.植物激素及其免疫檢測技術(shù)[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1996.

[7]陶慰孫,李惟,姜涌明,等.蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)[M].北京:高等教育出版社,1987.