五種血清型柯薩奇病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法研究

潘良文 黃一,2 李想 盧鐘山 呂蓉 劉月明 高琴 張舒亞

(1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局上海200135;2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院)

五種血清型柯薩奇病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法研究

潘良文1黃一1,2李想1盧鐘山1呂蓉1劉月明1高琴1張舒亞1

(1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局上海200135;2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院)

在柯薩奇病毒基因組VP1區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針,分別建立了特異性檢測(cè)5種血清型(A9、A16、B2、B3和B5型)柯薩奇病毒(Coxsackievirus)基于MGB探針的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。通過構(gòu)建的分別適于5種血清型病毒檢測(cè)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子對(duì)建立的檢測(cè)體系進(jìn)行了靈敏度分析,確定5種血清型柯薩奇病毒檢測(cè)體系的檢測(cè)下限均為2拷貝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA。

柯薩奇病毒;實(shí)時(shí)熒光RT-PCR;質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子;Taqman-MGB探針

1 前言

柯薩奇病毒(Coxsackievirus)屬于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬,據(jù)其生物學(xué)特點(diǎn)分為A組和B組兩類。人類感染柯薩奇病毒后分別引起皰疹性咽峽炎(A組)和非麻痹性類脊髓灰質(zhì)炎(B組)。據(jù)調(diào)查伴有口咽部皰疹和皮疹的急性熱病病例中,79%為柯薩克病毒A組所致,其中較常見的柯薩奇病毒A16型是引起手足口病的主要病原體之一?？滤_奇病毒B組是引發(fā)人類病毒性心肌炎的主要病原微生物[1]。

近年來,在北京、河南、沈陽等地先后發(fā)生多起柯薩奇病毒感染事件[2～4]。2005年5月河南發(fā)生一起柯薩奇病毒B5型疫情,歷時(shí)34d發(fā)病49例,14歲以下兒童罹患率達(dá)13.57%[2]。2006年我國(guó)衛(wèi)生部門統(tǒng)計(jì),全國(guó)各地共報(bào)告手足口病達(dá)13637例[4],有相當(dāng)一部分病例是感染A16型柯薩奇病毒所致。目前尚未研制出有效預(yù)防柯薩奇病毒的疫苗,因此加強(qiáng)柯薩奇病毒防控工作尤為重要。為了及時(shí)有效地發(fā)現(xiàn)病毒感染源,建立高效的柯薩奇病毒檢測(cè)方法是預(yù)防病毒感染和流行的關(guān)鍵技術(shù)手段之一。

國(guó)內(nèi)外研究者近幾年相繼報(bào)道了柯薩奇病毒的ELISA方法、普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR等方法[5～8]。雖然EL ISA方法能檢測(cè)早期病人血清中柯薩奇病毒的Ig M和IgG抗體,但該法因抗體制備困難、檢測(cè)靈敏度不高使應(yīng)用受到限制。基于核酸的PCR檢測(cè)技術(shù)成本低且快速,已廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)。前人的研究多基于Taqma-FAM-TAMRA探針,例如Tana(2008)等建立柯薩奇病毒A16型與腸道病毒71型的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法[5],但是針對(duì)單一血清型柯薩奇病毒實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)體系的研究相對(duì)較少。近來逐漸發(fā)展的Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、結(jié)果精確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn),適用于建立針對(duì)單一血清型病毒的檢測(cè)體系。因此,本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已備柯薩奇病毒株(A 9、A 16、B2、B3和B5型),設(shè)計(jì)高特異性的引物與M GB探針,建立了分別檢測(cè)以上5種血清型柯薩奇病毒的快速、高靈敏度實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。

2 材料與方法

2.1 供試病毒

滅活柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型及含GⅡ型諾如病毒糞便樣品均購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒預(yù)防控制研究所,血清Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗毒株懸浮液由美國(guó)加州大學(xué)學(xué)者惠贈(zèng)。

2.2 引物與探針設(shè)計(jì)

在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別查找柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型cDNA序列,并進(jìn)行比對(duì)和分析,尋找各血清型內(nèi)相對(duì)保守,但與其他血清型柯薩奇病毒以及腸道病毒同源性較低的區(qū)域。選擇柯薩奇病毒基因組外殼蛋白VP1編碼區(qū)分別設(shè)計(jì)引物和探針CoxA 9-F/R/P、CoxA 16-F/R/P、QCoxB 2-F/R/P、QCoxB 3-F/R/P和QCoxB 5-F/R/P,分別適于柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型的檢測(cè),引物和探針序列信息見表1。

2.3 病毒滅活疫苗、糞便樣品中病毒RNA提取

滅活柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型,含GⅡ型諾如病毒的糞便樣品和血清Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗樣品,使用T IANamp病毒RNA提取試劑盒(天根生物科技<北京>有限公司,Cat.No.:SD 101)進(jìn)行病毒RNA提取和純化。

2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

采用Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程<大連>有限公司,Cat.No.:DRR037A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為10μL,包括1×Buffer,0.5 μL RT Enzym e M ix,0.5μLO ligo(dT)(0.125μM),5μL RNA溶液。反應(yīng)條件為:37℃,15 m in;85℃,5s。

2.5 PCR反應(yīng)

2.5.1 普通PCR反應(yīng)

使用普通PCR試劑盒(東洋紡<上海>生物科技有限公司,Cat.No.:BTQ-201)。PCR反應(yīng)體系為25μL,其中包括1×PCR Buffer,1.25 U B lend Taq-PlusDNA聚合酶,0.4μM上游引物,0.4μM下游引物,0.2 mM dNTPs,2μL cDNA溶液。引物EV 1/2[10]反應(yīng)條件為:94℃,2 m in;94℃,30s,60℃,1 m in,72℃,1 m in;45個(gè)循環(huán)。引物GⅡ-SKF/R[11]反應(yīng)條件為:94℃,2 m in;94℃,30 s,50℃,30 s,72℃,1 m in;45個(gè)循環(huán)。

分別取PCR產(chǎn)物15μL,加1.5μL 10×上樣緩沖液點(diǎn)樣,并加DNA分子量標(biāo)記DL 2000(寶生物工程<大連>有限公司,D 501A)點(diǎn)樣以判斷PCR產(chǎn)物的片段大小。電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠分析成像系統(tǒng)記錄。

2.5.2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

使用Prem ix Ex TaqT M試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司,Cat.No.:DRR039A)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng),反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)條件為:94℃,10 s;94℃,5 s,60℃,31 s,45個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均重復(fù)3次。以柯薩奇病毒RNA或其cDNA作為陽性對(duì)照,以不含有柯薩奇病毒的RNA或cDNA作為陰性對(duì)照,以水代替模板作為空白對(duì)照。

表2 柯薩奇病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系

2.6 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建

分別采用引物QCoxA 9-F/R、QCoxA 16-F/R、QCoxB2-F/R、QCoxB3-F/R和QCoxB5-F/R以表1中目標(biāo)血清型病毒cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增(如:引物CoxA 9-F/R以柯薩奇病毒A 9型cDNA為模板),目的片段大小分別為91bp、174bp、76bp、80bp和145bp。回收純化以上片段,克隆至pMD-18T載體中(寶生物工程<大連>有限公司),經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定確定陽性克隆。得到分別含有柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B 3和B 5型VP1區(qū)特異性片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-A 9、pMD-A 16、pMD 18-B2、pMD 18-B3和pMD 18-B5。為了建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,將構(gòu)建的五種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子分別稀釋至106、105、104、103、102、101拷貝/μL,并進(jìn)一步稀釋至5、1拷貝/μL用于檢測(cè)下限分析。

3 結(jié)果

3.1 建立的柯薩奇病毒RT-PCR檢測(cè)體系特異性測(cè)試

為了測(cè)試建立的柯薩奇病毒實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)體系特異性,以A 9、A 16、B2、B 3和B 5型柯薩奇病毒及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒及GⅡ型諾如病毒cDNA為模板,分別采用引物和探針QCoxA 9-F/R/P、QCoxA 16-F/R/P、QCoxB2-F/R/P、QCoxB 3-F/R/P、QCoxB 5-F/R/P,對(duì)以上模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,柯薩奇病毒A 9型檢測(cè)體系只以柯薩奇病毒A 9型cDNA為模板時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,以其他清型柯薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒及諾如病毒cDNA為模板時(shí)均未見擴(kuò)增信號(hào);同樣,其他4種血清型柯薩奇病毒RT-PCR檢測(cè)體系僅在擴(kuò)增目標(biāo)血清型病毒cDNA的反應(yīng)中出現(xiàn)熒光幅增,以其他毒cDNA為模板時(shí)均未見擴(kuò)增信號(hào)(表3)。為避免假陰性,用腸道病毒檢測(cè)引物EV 1/2[10]對(duì)柯薩奇病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA樣品進(jìn)行檢測(cè),均可擴(kuò)增得到435 bp的目的片段。對(duì)GⅡ型諾如病毒cDNA樣品使用引物GⅡ-SKF/R[11]進(jìn)行擴(kuò)增,得到344 bp的目的片段(數(shù)據(jù)未在此呈現(xiàn)),表明上述病毒RNA均已成功分離并被反轉(zhuǎn)錄為cDNA,可用于PCR擴(kuò)增。因此,引物和探針QCoxA 9-F/R/P高度特異于A 9型柯薩奇病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè);引物和探針QCoxA 16-F/R/P、QCoxB2-F/R/P、QCoxB3-F/R/P、QCoxB5-F/R/P也同樣地分別特異于目標(biāo)血清型柯薩奇病毒的檢測(cè)。

表3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系的特異性試驗(yàn)

續(xù)表3

3.2 柯薩奇病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD 18-A 9、pMD 18-A 16、pMD 18-B2、pMD 18-B3和pMD 18-B5稀釋至106、105、104、103、102、101拷貝/μL,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng),每一梯度模板重復(fù)3次反應(yīng),分別制備A 9、A 16、B2、B3、B5型柯薩奇病毒RT-PCR檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),各梯度平均Ct值及其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。

圖1 五種血清型柯薩奇病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1、表4可以看出,5種血清型病毒檢測(cè)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2>0.999)。5種血清型柯薩奇病毒回歸方程斜率分別為-3.33、-3.17、-3.34、-3.33和-3.14,根據(jù)PCR反應(yīng)效率公式(E=10-1/slope-1,slope為斜率)計(jì)算,得反應(yīng)效率分別為:99.25%、99.66%、107.97%、99.66%和106.54%,各梯度模板的C t值間隔均勻,標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)均低于0.218,可重復(fù)性良好,符合PCR反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)要求。因此,以上結(jié)果表明本研究建立的檢測(cè)體系適用于樣品定量分析。

表4 柯薩奇病毒五種血清型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子檢測(cè)體系可重復(fù)性測(cè)試

3.3 建立的柯薩奇病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系靈敏度分析

為了分析建立的檢測(cè)體系靈敏度,以5、1拷貝/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD18-A 9為模板,每個(gè)濃度各重復(fù)10次,均出現(xiàn)熒光幅增,結(jié)果1拷貝/μL以上質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA濃度模板均檢測(cè)到明顯的擴(kuò)增。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-B 3、pMD-B 5、pMD-A 9和pMD-A 16的10倍梯度稀釋液為模板時(shí),得到相似結(jié)果,即1拷貝/μL以上濃度為模板時(shí)均可檢測(cè)出明顯的熒光幅增。因此,建立的適于五種血清型柯薩奇病毒檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)下限均可達(dá)到2拷貝(模板量為2μL)。

4 討論

柯薩奇病毒血清型多達(dá)30種,且型與型之間基因組變異度較大,因此設(shè)計(jì)適于柯薩奇病毒所有血清型的通用檢測(cè)引物非常困難,目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究報(bào)道也較少。為了對(duì)柯薩奇病毒實(shí)施有效監(jiān)控,建立快速有效的柯薩奇病毒檢測(cè)方法至關(guān)重要,根據(jù)柯薩奇病毒各血清型內(nèi)相對(duì)保守的特點(diǎn),本研究針對(duì)柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型分別設(shè)計(jì)了一套引物和探針。為了保證檢測(cè)的高特異性和靈敏度,選擇了Taqm an-MGB探針用于檢測(cè)。經(jīng)測(cè)試,5套引物和探針QCoxA 9-F/R/P、QCoxA 16-F/R/P、QCoxB2-F/R/P、QCoxB3-F/R/P和QCoxB5-F/R/P均特異于對(duì)應(yīng)血清型柯薩奇病毒的檢測(cè)。

基于已構(gòu)建的柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子,本研究對(duì)5種血清型病毒檢測(cè)體系進(jìn)行靈敏度分析,得到了5種血清型病毒檢測(cè)體系靈敏度均為2拷貝質(zhì)粒DNA,制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2>0.999)。Kageyam a T等(2003)[12]建立的諾如病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系靈敏度為10拷貝質(zhì)粒DNA,標(biāo)準(zhǔn)曲線判定系數(shù)R2=0.995/0.998;潘良文等(2004)[13]對(duì)貝類產(chǎn)品中諾如病毒檢測(cè)建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR體系檢測(cè)下限約為6拷貝質(zhì)粒DNA,標(biāo)準(zhǔn)曲線判定系數(shù)R2=0.9944。從以上結(jié)果分析表明本研究建立的檢測(cè)體系靈敏度以及標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果與以上報(bào)道相當(dāng)。

因此,本研究建立的分別針對(duì)柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法具有特異性好和靈敏度高的特點(diǎn),能夠滿足日常檢驗(yàn)檢疫的要求。

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Research on Detection of Five Serotypes of Coxsackie Viruses with Real-Time RT-PCR

Pan Liangwen1,Huang Yi1,2,Li Xiang1,Lu Zhongshan1,Lv Rong1,Liu Yueming1,Gao Qin1,Zhang Shuya1
(1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai,200135;2.School of Bioengineering,East China University of Science and Technology)

Based on the VP1 region of Coxsackivirus genome,primer and probe sets have been designed to detect five serotypes of Coxsackieviruses(A9,A16,B2,B3 and B5)separately by real-time RT-PCR.Plas mid standard molecules suitable for coxsackieviruse A9,A16,B2,B3 and B5 detection were constructed respectively.Limits of detection(LODs)of the developed detection systems for five serotypes of Coxsackieviruse were all 2 copies of plasmid standard molecule DNA.

Coxsackievirus;Plasmid Standard Molecule;Rea1-Time RT-PCR;Taqman-MGB Probe

TS245.7

上海技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專項(xiàng)(07DZ05026);國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2007B150);科技部世博科技專項(xiàng)(2009BAK 43B31);上海市科委創(chuàng)新平臺(tái)服務(wù)項(xiàng)目項(xiàng)目(10DZ2294102)