磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

林麗聰 樊海平 廖碧釵 余培建 鐘全福

(福建省淡水水產(chǎn)研究所 福建福州 350002)

磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

林麗聰 樊海平 廖碧釵 余培建 鐘全福

(福建省淡水水產(chǎn)研究所 福建福州 350002)

在(25±1)℃水溫條件下,以300 m g/kg的單劑量,給歐洲鰻鱺混飼口灌磺胺嘧啶后,用高效液相色譜法測(cè)定血漿和肌肉中的藥物濃度,研究了磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果表明:歐洲鰻鱺血漿和肌肉中磺胺嘧啶經(jīng)時(shí)過程均符合一級(jí)吸收二室開放模型,其理論方程為:C血漿=196.16e-0.0308t+44.028e-0.0067t-7.9584e-0.0871t,血漿中藥物主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)如下:T1/2ka為7.9584h;T1/2a為22.473h;T1/2β為104.27h;Tmax為21.512h;Cmax為100.51m g/L。C肌肉=0.077e-0.061t+34.545e-0.015t-3.8399e-0.181t,肌肉中主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)如下:T1/2ka為3.8399h;T1/2a為11.277h;T1/2β為46.210h;Tmax為15.762h;Cmax為25.024m g/kg。以20μg/kg為最高殘留限量計(jì)算,在本試驗(yàn)條件下,建議磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的休藥期不低于48d。

歐洲鰻鱺;磺胺嘧啶;高效液相色譜;藥代動(dòng)力學(xué)

1 前言

磺胺類藥物是目前國(guó)內(nèi)水產(chǎn)領(lǐng)域使用程度僅次于抗生素的藥物,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性豎鱗病、爛鰓病、弧菌病、癤瘡、赤鰭病、腸炎、鞭毛蟲病有良好的防治效果,因而得到了廣泛應(yīng)用[1]。該類藥物在人體內(nèi)的作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng),當(dāng)蓄積濃度超過一定量時(shí)將對(duì)人體機(jī)能產(chǎn)生損害,引起過敏、泌尿系統(tǒng)和造血系統(tǒng)功能紊亂等不良反應(yīng)[2]。近年來,日本、歐盟等主要進(jìn)口國(guó)對(duì)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全要求越來越嚴(yán)格,日本肯定列表中將動(dòng)物源性食品的磺胺類殘留總量最低限量定為20μg/kg;歐盟2377/90/EEC中也明確規(guī)定,在所有動(dòng)物源性食品中磺胺類殘留總量不能超過100μg/kg;農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY5070-2002中規(guī)定磺胺類在水產(chǎn)品中總量不得超過100μg/kg。在我國(guó)地標(biāo)升國(guó)標(biāo)漁藥目錄中,磺胺嘧啶已成為國(guó)標(biāo)漁藥。鰻鱺是我國(guó)出口水產(chǎn)品的重要品種之一,目前未見有關(guān)磺胺嘧啶在鰻鱺體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和殘留的研究報(bào)道,因而深入研究磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的分布、殘留與代謝規(guī)律,將為磺胺嘧啶的殘留檢測(cè)工作和臨床使用技術(shù)的制定提供理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla),由福建省福清三華飼料有限公司提供,平均體重150±20g,試驗(yàn)前暫養(yǎng)在水泥池中60d,正常投餌換水管理,水溫為18～28℃。試驗(yàn)在50cm×80cm不銹鋼水族箱中進(jìn)行,每箱放水200L,放鰻鱺25尾,不間斷沖氣增氧,不投餌,水溫控制在(25±1)℃。試驗(yàn)前鰻鱺經(jīng)抽查證明組織中均不含磺胺嘧啶。

2.2 藥品及試劑

磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品:含量99.9%,由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;磺胺嘧啶原料藥:含量98%,購自重慶西南合成藥業(yè);乙腈:HPLC級(jí);其它試劑均為分析純。?

2.3 高效液相色譜儀及色譜條件

采用Agilent 1200型高效液相色譜(HPLC)儀(色譜柱類型:Eclipse XDB-C184.6×250mm 5μm);多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器;流動(dòng)相:乙腈:0.05M磷酸二氫銨(20:80,V/V);流速:0.8 mL/min;柱溫:室溫;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):270nm;進(jìn)樣量:50μL。

2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣

稱取磺胺嘧啶原料藥適量于200mL容量瓶中,加入未加淀粉的鰻魚基礎(chǔ)飼料,加水配置成含磺胺嘧啶400mg/mL的糊狀液。按300mg/kg單劑量口灌給藥,無回吐者保留實(shí)驗(yàn)。給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、5、8、12、24、32、48、72、120、240、480、720、1080、1440h分別采集魚體的血液、肌肉,每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)采魚樣5尾。血液置于含少量1%肝素鈉(已風(fēng)干)離心管中混勻,5000 r/min離心5min分離血漿,血漿、肌肉于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 樣品處理

2.5.1 血漿

取出冷凍保存的血漿樣品,室溫下自然解凍,準(zhǔn)確吸取1mL置于15mL具塞塑料離心管中,加入3mL甲醇,漩渦混合5min,5000r/min離心5min,吸取上清液轉(zhuǎn)移到另一15mL具塞塑料離心管中;重復(fù)1次,合并上清液,于50℃氮?dú)獯蹈?殘余物加1mL流動(dòng)相溶解,離心,過0.45μm濾膜,取50μL上機(jī)檢測(cè)。

2.5.2 肌肉

將肌肉樣品勻漿,準(zhǔn)確稱取2.0g于50mL離心管中,加入4mL10%硫酸鈉和6mL乙腈:氯仿(10:1),漩渦混合5min,5000r/min離心5min,吸取上清液轉(zhuǎn)移到1支15mL具塞塑料離心管中;殘?jiān)偌?mL乙腈:氯仿(10:1),重復(fù)操作1次,合并上清液,于50℃氮?dú)獯蹈?殘余物加2mL流動(dòng)相溶解后,加4mL流動(dòng)相飽和的正己烷去脂1次,下層液過0.45μm濾膜,取50μL上機(jī)檢測(cè)。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品10mg于25mL容量瓶中,加乙腈制成400μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4℃避光保存?zhèn)溆?臨用前用流動(dòng)相稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。稱取5份空白樣品(血漿或肌肉)分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作液適量,配制成含磺胺嘧啶為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mg/L的血漿樣品和0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mg/kg的肌肉樣品,然后按照1.5方法對(duì)樣品處理后,上機(jī)測(cè)定其峰面積,求出血漿和肌肉的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.7 回收率和精密度

取空白樣品,添加適量磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)工作液,配制成含磺胺嘧啶為0.05、0.1和0.5mg/L 3個(gè)系列濃度的血漿樣品和0.05、0.1和0.5mg/kg 3個(gè)系列濃度的肌肉樣品,按1.5方法對(duì)樣品處理后,用高效液相色譜儀測(cè)定,計(jì)算回收率。

將上述不同濃度的樣品于ld內(nèi)分別重復(fù)進(jìn)樣5次和分5d測(cè)定,計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。

2.8 模型及參數(shù)的確定

將歐洲鰻鱺血漿與肌肉中磺胺嘧啶濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)(C-T)用PKS藥動(dòng)學(xué)分析程序在微機(jī)上進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)處理,給出藥物代謝所符合的模型和參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的色譜行為

在上述色譜條件下,磺胺嘧啶的色譜峰尖銳且對(duì)稱,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品保留時(shí)間均為5.6min左右。樣品中雖有雜峰出現(xiàn),但與藥物目標(biāo)峰分離良好;空白血漿和肌肉中均無磺胺嘧啶峰。見圖1。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測(cè)限

在0.05～2.0mg/L線性范圍內(nèi),歐洲鰻鱺血漿和肌肉中磺胺嘧啶的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。從表1可知,在此線性范圍內(nèi),磺胺嘧啶在血漿和肌肉中線性關(guān)系良好。以引起3倍基線噪音的藥物濃度為最低檢測(cè)限,該方法的最低檢測(cè)限為5μg/L,滿足磺胺嘧啶的殘留分析要求。

表1 歐洲鰻鱺血漿和肌肉中磺胺嘧啶的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖1 磺胺嘧啶色譜圖

3.3 回收率及精密度

分別對(duì)3種不同質(zhì)量濃度的磺胺嘧啶在血漿和肌肉中的回收率及精密度進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表2。由表2可知,血漿中平均回收率為(87.18±1.85)%,日內(nèi)精密度為1.28%、日間精密度為3.58%;肌肉中平均回收率為(79.49±3.83)%,日內(nèi)精密度為2.03%、日間精密度為3.12%。說明該方法準(zhǔn)確度高,重復(fù)性好,符合藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究要求。

表2 歐洲鰻鱺血漿和肌肉中磺胺嘧啶的回收率及精密度(n=5)

3.4 磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的濃度變化及代謝動(dòng)力學(xué)特征

以300m g/kg單劑量口灌給藥后,藥物在血漿中吸收、分布、消除速率均較肌肉中慢,達(dá)峰時(shí)間長(zhǎng),峰濃度值高。將磺胺嘧啶濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用PKS藥動(dòng)學(xué)程序進(jìn)行分析,根據(jù)A IC值最小和R2值最大的原則,判定歐洲鰻鱺單劑量口灌磺胺嘧啶后血漿及肌肉中的藥物經(jīng)時(shí)過程均符合一級(jí)吸收二室開放模型,其理論方程為:C血漿=196.16e-0.0308t+44.028 e-0.0067t-7.9584 e-0.0871t;C肌肉=0.077e-0.0615t+34.545 e-0.0150t-3.8399e-0.1805t。藥時(shí)曲線見圖2,詳細(xì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3。

圖2 歐洲鰻鱺口灌磺胺嘧啶(300m g/kg)后血漿和肌肉中的藥時(shí)曲線

表3 磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

4 討論與結(jié)論

4.1 磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征

比較磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺血漿和肌肉中的濃度變化,磺胺嘧啶在血漿和肌肉中的變化趨勢(shì)基本一致,只是在不同時(shí)間段各組織內(nèi)藥物濃度各有高低?；前奉愃幬镌诮M織中有一個(gè)較為特殊的代謝過程,稱為乙?；?即磺胺類藥物與乙酰輔酶A結(jié)合生成無活性的代謝產(chǎn)物乙?；前?,磺胺類藥物通過這一途徑的代謝速度很快。Sam uelsen等[3]報(bào)道了SDM、S M Z、S M 2、SGD 4種磺胺類藥物在大西洋鳙鰈(H ippog lossus h ippog lossus)肌肉內(nèi)的乙?；史謩e為93%、89%、11%、9%;以200m g/kg濃度水浴72h后測(cè)得以上4種藥以及T M P在肌肉內(nèi)的最高濃度分別為2.1、6.1、24.4、32.6、99.0μg/mL。說明乙?；实母叩团c藥物在組織中的濃度大小有很大關(guān)系。Sam uelsen等[4]研究了SDM在大西洋鮭體內(nèi)的代謝清況,結(jié)果顯示SDM在血液、肌肉、肝臟、腎臟4種組織中濃度分別為14.3、17.7、7.4、6.8μg/m L;認(rèn)為乙酰化是SDM在大西洋鮭體內(nèi)代謝的主要途徑。本研究血漿中的藥物濃度與肌肉內(nèi)的藥物濃度相比始終保持較高水平,這可能與磺胺類藥物的乙酰化使其在肌肉中濃度較低有關(guān),具體情況還有待進(jìn)一步研究。

磺胺嘧啶在血漿及肌肉的代謝過程中,其藥物濃度均出現(xiàn)兩次出峰的現(xiàn)象,原因可能是某些臟器對(duì)藥物存在再吸收[5],比如肝腸循環(huán)的作用,使得藥物二次吸收,濃度升高。這種現(xiàn)象在日本學(xué)者煙井等[6]測(cè)定氯霉素在魚血液中含量,測(cè)定磺胺在虹鱒魚血漿中濃度時(shí)都出現(xiàn)過。李美同等[7]進(jìn)行土霉素在鰻鱺體內(nèi)的殘留研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)由于再吸收引起肝中藥物濃度二次升高的現(xiàn)象。

4.2 磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的殘留及休藥期

磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺血漿和肌肉中的消除半衰期分別為104.27h和46.210h,說明磺胺嘧啶在肌肉中消除較血漿中要快。日本《食品中殘留農(nóng)藥肯定列表制度》中規(guī)定鰻鱺目中磺胺嘧啶的最高殘留限量(MRL)為20μg/kg。若根據(jù)食用組織中殘留濃度來確定休藥期,則第21d就可以達(dá)到要求,而血漿中則需48d才達(dá)到要求。為了充分保障消費(fèi)者的安全,選擇肌肉中未檢測(cè)出藥物且血漿中藥物濃度低于20μg/kg的時(shí)間為可以起捕食用的時(shí)間。因此初步建議在(25±1)℃水溫條件下,以300 m g/kg單劑量對(duì)歐洲鰻鱺混飼口灌給藥,休藥期至少為給藥后48d,起捕食用才是安全的。由于藥物在體內(nèi)的消除受許多因素的影響,因此,休藥期的制定應(yīng)結(jié)合給藥方式、投餌量、養(yǎng)殖管理方式等多方面因素,本研究結(jié)果可作為一個(gè)重要的參考數(shù)據(jù)。

[1] 王群,馬向東,李紹偉.HPLC法研究磺胺類藥物在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的代謝和殘留[J].科技瞭望,1999,(6):33～36.

[2]李孟玻,張德云,彭之見,等.高效液相色譜法測(cè)定魚肉中殘留磺胺類藥物[J].理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊(cè),2006,42(8):611～613,619.

[3]Samuelsen O B,Lunestad B T,JelmertA.Pharmacokinetics and efficacy studies on bath-administering potentiated Sulphonamides in Atlantic halibut Hippogl-ossus hippoglossus[J].Fish D is,1997,20:287～290.

[4]Samuelsen O B,PurseⅡL,Smith P,et al.Multiple-dose Pharmacokinetics study of Romet30 in A tlanticsalmon(Salmosalar)and in vitro antibacterial activity against Aeromonas[J].Aquaculture,1997,152:287～296.

[5] 馮淇輝.獸醫(yī)抗菌藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1987:50～120.

[6] 田中二良著.劉世英等譯.水產(chǎn)藥詳解[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1982:58～87.

[7] 李美同,郭文林等.土霉素在鰻鱺組織中殘留的消除規(guī)律[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),1997,21(1):39～43.

Pharmacokinetics of Sulfadiazine in European eels(Anguilla anguilla)

Lin Licong,Fan Haiping,Liao Bichai,Yu Peijian,ZhongQuanfu
(The Fresh water Fisheries Research Institute of Fujian Province,Fuzhou,Fu jian,350002)

In order to study the pharmacokinetics of Sulfadiazine(SD)in European eels(Anguilla anguilla),the eels were treated orally with Sulfadiazine-blended feeds at a single dose of 300m g·kg-1bodyweight at water temperature of(25±1)℃.The SD concentrations of p las m a and muscle were determined by high perform anceliquid chromatography(HPLC).The results show ed that both the plasma and muscle concentration-time course of SD conform ed to a two-compartment open model with the first order absorption.The pharmacokinetic equations were as follow s:Cplasma=196.16e-0.0308t+44.028 e-0.0067t-7.9584e-0.0871t,the main pharmacokinetic parameters were:T1/2kawas 7.9584h;T1/2a,22.473h;T1/2β,104.27h;Tmax,21.512h;Cmax,100.51m g·L-1.Cmuscle=0.077e-0.061t+34.545e-0.015t-3.8399e-0.181t,the main pharmacokinetic parameters were:T1/2kaw as 3.8399h;T1/2a,11.277h;T1/2β,46.210h;Tmax,15.762h and Cmaxwas 25.024m g·kg-1.According to the maximum residual limit(MRL)of 20μg·kg-1,the with drawl period should no t be less than 48 days under this experiment condition.

Anguilla anguilla;Sulfadiazine;High Performance Liquid Chromatography(HPLC);Pharmacokinetics

S965.223 S859.7

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(nyhyzx07-043-10);福建省海洋與漁業(yè)廳專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2009001)