氫氧化鋁佐劑對Nogo-66免疫原性的影響

岳紅云, 賀翔鴿, 燕振國, 曹 虹, 馬巖梅

(1蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院眼科, 蘭州 730050; 2第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院眼科; *通訊作者,E-mail:Xiangge he@hotmail.com)

為了加強機體對一定免疫原的免疫應答,常應用各種免疫促進劑,稱為免疫佐劑(immunological adjuvant,IA),佐劑與免疫原混合,可以加強對免疫原的免疫應答能力。佐劑增強對免疫原的免疫應答,但并不賦予半抗原免疫原性。

Nogo-66蛋白的等電點為6.09;當 pH＞pI的溶液中,蛋白質為陰離子,根據(jù) Nogo-66蛋白的等電點,當 pH=7時,Nogo-66在電場中向陽極移動;而中性 pH值時,硫酸鋁帶負電荷,氫氧化鋁帶正電荷。因此,選擇 Nogo-66蛋白的適合佐劑時,選擇氫氧化鋁為適合佐劑。

在已經證實 Nogo-66蛋白免疫原性[1]的基礎上,本實驗擬驗證其生物效應及免疫反應過程的特征,試圖了解氫氧化鋁佐劑對Nogo-66蛋白免疫原性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡正常成年 SD大鼠 48只,體重 200-220 g,雌雄不拘,動物由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(渝)2003.0003。

1.2 方法

1.2.1 氫氧化鋁佐劑的Nogo-66蛋白吸附率計算

氫氧化鋁佐劑與 Nogo-66蛋白吸附方法:取氫氧化佐劑混懸液 1 ml后,按照說明書,與 4%Nogo-66蛋白溶液以體積比例 1∶1,1∶2,1∶3配制,充分微量震蕩混勻 30 min。

微板考馬斯亮藍蛋白定量法計算上清液中的Nogo-66蛋白質濃度:①500 r/min離心混合后的氫氧化鋁佐劑與 Nogo-66蛋白質 1 min,取上清液,分別標記體積比例 1∶1,1∶2,1∶3為樣本 1,2,3。 ②10 mg考馬斯亮藍 G-250溶于 5 ml 95%乙醇溶液,加入 85%磷酸 10 ml,混勻,取 1.5 ml母液,其余部分作為儲存液保存于 4度冰箱。③于 1.5 ml母液中加入雙蒸水8.5 ml,作為工作液,制作標準曲線。④樣本 1,2,3中 Nogo-66蛋白質濃度測量。

氫氧化鋁佐劑的Nogo-66蛋白吸附率計算:按照公式[1]:氫氧化鋁佐劑的Nogo-66蛋白的吸附率=(原有蛋白質量-上清液中蛋白質的量)/原有蛋白質量×100%。樣本 1,2,3中,Nogo-66蛋白的吸附率分別為20.57%,21.06%,20.88%。

1.2.2 吸附氫氧化鋁佐劑的Nogo-66蛋白免疫大鼠 健康 8周齡 SD大鼠 40只,隨機納入蛋白質組與高劑量佐劑組、中劑量佐劑組及小劑量佐劑組各10只,各組動物均采用 1%異戊巴比妥鈉 0.8 ml腹腔注射麻醉。所有實驗動物于實驗第1天開始免疫,接種頻次 1次 /7 d,免疫 4次。

免疫注射液配制及注射方法:將凍干粉 Nogo-66蛋白用等滲 PBS稀釋至 4 mg/ml,按照前述氫氧化鋁佐劑與 Nogo-66蛋白吸附比例與方法配制注射液后,稀釋 10倍,給予實驗大鼠 1 ml背部及雙后趾皮下多點注射。對照組實驗動物以相同時間及頻次給予 1 ml等滲 PBS背部及雙后趾皮下多點注射對照。

1.2.3 流式細胞術檢測處于活躍分裂期細胞數(shù)目

計算處于增殖期細胞的數(shù)量及占細胞總量的百分比,周期中 S及 G2/M期細胞百分比。于初次免疫后8 d,16 d不同時間段取各組 SD大鼠各 5只。同前方法麻醉大鼠,取出新鮮大鼠脾臟后,提取細胞,淋巴細胞分層液分離脾臟淋巴細胞。流式細胞檢測儀進行檢測。

2 結果

2.1 一般情況 實驗動物共 40只,試驗過程中,各組均無死亡大鼠。所有大鼠試驗數(shù)據(jù)均符合統(tǒng)計學分析要求。

2.2 各實驗組脾淋巴細胞增殖能力檢測 蛋白質組、高劑量佐劑組、中劑量佐劑組及小劑量佐劑組的SD大鼠脾淋巴細胞經過流式細胞儀檢測結果見表1,表2,圖1。高劑量佐劑組的脾淋巴細胞增殖程度為最小,中劑量佐劑組與小劑量佐劑組無統(tǒng)計學差異,而與高劑量佐劑組有統(tǒng)計學差異。三組比單純蛋白質組的免疫原性均較低,差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

神經系統(tǒng)損傷后,局部級聯(lián)反應的損傷抗原Nogo-66具有明確的免疫原性[1],通過免疫佐劑的吸附之后,能否得到更強免疫原性,從而對于神經免疫保護過程起到持久作用,是前期實驗基礎上所要完成的內容。

本試驗中,應用不同吸附比例氫氧化鋁懸液(alum precipitate,AP),對Nogo-66蛋白質進行處理,目的是促進抗原的吸收,并使抗原連續(xù)緩慢在受試動物機體釋放,從而判斷佐劑能否增強實驗動物對M[TM]攝取和處理抗原的活性。應用在不同時間觀察分相情況,并及時檢查吸附度的方法,監(jiān)測上清中抗原的量,除以制造時加入抗原的總量,計算吸附百分率。通過分析各時間段淋巴細胞增殖情況[2],判斷 Nogo-66蛋白的免疫原性及其促進淋巴增殖的時間峰值。所得到的數(shù)據(jù)證實,佐劑存在的前提下,刺激 T淋巴細胞的免疫原性較單純的Nogo-66蛋白降低[3]。

鋁佐劑的作用機制主要表現(xiàn)在吸附率越高,佐劑效果越明顯。很小劑量的鋁可以使抗原完全吸附,但不能達到最好的佐劑效果。使用鋁佐劑,除了100%吸附的劑量外,尚需附加量的鋁佐劑[4]。其原因可能是免疫局部有足夠量的鋁佐劑,以確保逐步釋放抗原[5]。佐劑本身可能刺激吞噬細胞活性,但是過多的佐劑抑制抗原釋放。本實驗中,氫氧化鋁佐劑對Nogo-66的影響表現(xiàn)為對免疫原性的抑制作用,其原因可能在此。

表1 免疫后4 d SD大鼠脾臟 T淋巴細胞增殖結果Tab 1 Comparison of proliferation of T lymph cells in SD rats after immunization for 4 d among 4 groups

表2 SD大鼠脾臟T淋巴細胞增殖結果 (免疫后8d)Tab 2 Comparison of proliferation of T lymph cells in SD rat after immunization for 8 d among 4 groups

圖1 免疫后4d淋巴細胞周期流式圖Fig 1 The cell cycle of T lymph cells after immunization for 4 d by flow cytometry

Nogo-66蛋白在進入體內后,根據(jù)其抗原表位的特征,只有通過吞噬細胞的處理,才能夠暴露抗原表位的小肽段,從而刺激 T淋巴細胞,激活后者的免疫作用[6]。但是由于鋁佐劑對吞噬細胞有細胞毒作用,因此,可能導致對于蛋白的處理能力降低,表現(xiàn)抗原表位肽段表達程度降低后,細胞免疫功能下降[7]。

如果實驗的目的在于制成人用疫苗,為了降低EAE發(fā)生可能性,最初的實驗步驟中,并不苛求非常高的免疫原性[8]。重要點在于中樞神經系統(tǒng)能否達到如周圍系統(tǒng)一樣的免疫應答,激活相對免疫赦免系統(tǒng)的EAE之前,Nogo-66蛋白激活損傷抗原特異性 T淋巴細胞,完成損傷過程中被損害的免疫系統(tǒng)的修復。

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