不同劑量三氧化二砷單獨及聯(lián)合順鉑對人宮頸癌移植瘤的作用及機(jī)制

周曦　陳忠東

[摘要] 目的 探討不同濃度的三氧化二砷（As2O3）與順鉑單獨或合用對宮頸癌裸鼠移植瘤的療效和毒副作用。 方法 取人宮頸癌細(xì)胞接種于裸鼠的皮下，建立裸鼠移植瘤模型，按照用藥的不同分為觀察組六組與對照組一組，對照組給予生理鹽水用藥；觀察組六組分別給予三氧化二砷單獨使用、順鉑單獨使用及順鉑聯(lián)合三氧化二砷使用；通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、HE染色觀察用藥后的毒副作用。 結(jié)果 觀察組各組的瘤質(zhì)量及細(xì)胞的凋亡率顯著優(yōu)于對照組，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。觀察組各組藥物治療后出現(xiàn)一定程度上的白細(xì)胞降低，順鉑藥物組出現(xiàn)骨髓抑制明顯；其他血紅蛋白、血小板值較對照組顯著下降；用藥后觀察組裸鼠的血尿素氨水平、丙轉(zhuǎn)氨酶值有所升高；順鉑藥物組的肝腎損傷較為明顯，與對照組相比數(shù)值顯著升高。 結(jié)論 三氧化二砷聯(lián)合順鉑治療宮頸癌移植瘤，有效的促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)了抑制癌細(xì)胞增殖的作用，促進(jìn)了臨床的治療效果，臨床效果顯著，值得推廣。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌移植瘤；三氧化二砷；順鉑；裸鼠

[中圖分類號] R737.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）01-44-04

[Abstract] Objective To study the effect and toxicity of different concentrations of arsenic trioxide （As2O3） and cisplatin used alone or in combination on cervical cancer in nude mice. Methods Human cervical cancer cells were inoculated subcutaneously in nude mice， nude mouse xenograft modelas were divided into six observation groups and one control group according to the different treatment ，the control group was given normal saline treatment.The observation group of six groups were treated with arsenic trioxide alone， cisplatin alone and combined use of two.To detect apoptosis by flow cytometry， and the toxic side effect was observed by HE staining. Results Tumor mass and apoptosis rate of cell in observation group were significantly better than the control group， P<0.05.After the treatment，observation group appeared to blood cell decrease ， and cisplatin group appeared bone marrow suppression significantly.Hemoglobin， platelet values significantly lower than control group.After treatment， the nude mice blood urea nitrogen level， alanine aminotransferase values increased.Liver and kidney injury in cisplatin group increased obviously than the control group. Conclusion Arsenic trioxide combined with cisplatin in the treatment of cervical cancer xenograft promote the apoptosis of cancer cells and the clinical therapeutic effect effectively， enhanced the inhibition of cancer cell proliferation， it is worthy of promotion with good clinical effect.

[Key words] Cervical cancer xenograft； Arsenic trioxide； Cisplatin； Nude mice

宮頸癌是臨床婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率居婦科惡性腫瘤之首。近些年來，該病的發(fā)病率有逐年增高的趨勢。目前，臨床的綜合治療主要以手術(shù)及化療為主，但化療的藥物毒副作用大，尤其是肝腎功能損傷及骨髓抑制，且耐藥性的問題也逐漸增加，影響了臨床化療的效果[1-3]。因此，

尋找最佳的低毒高效化療藥物或增加已有化療藥物的效果具有重要的臨床意義。故本實驗通過對建立的宮頸癌裸鼠移植瘤模型實施不同劑量的三氧化二砷單獨及聯(lián)合順鉑的治療，觀察藥物對腫瘤的抑制作用及產(chǎn)生的不良反應(yīng)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 人宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞采用含100μg/mL的青霉素，100μg/mL的鏈霉素，10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃，5% CO2飽和度的培養(yǎng)箱下培養(yǎng)，每天換液一次，2～3d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 移植瘤的建立 取對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞1×107/mL，將細(xì)胞懸浮液0.2mL注射于裸鼠的背部皮下，接種10～14d后，皮下移植瘤可達(dá)75～100mm3。

1.2.3 分組 按照用藥的不同分為觀察組六組與對照組一組，觀察組六組用藥情況如下：觀察組一組給予三氧化二砷0.8mg/kg治療；觀察組二組給予三氧化二砷2.4mg/kg治療；觀察組三組給予順鉑5mg/kg治療；觀察組四組給予順鉑10mg/kg治療；觀察組五組給予三氧化二砷（0.4mg/kg）聯(lián)合順鉑（2.5mg/kg）治療；觀察組六組給予三氧化二砷（1.2mg/kg）聯(lián)合順鉑（5mg/kg）治療；幾組分別按照預(yù)定的給藥途徑（腹腔注射），隔日給藥1次，10次（20d）為一個治療療程。臨床治療APL的患者三氧華二砷的治療量為每日10mg/kg，人體重按60mg計算，即0.17mg/kg，約為小鼠LD50的1/71。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 成瘤率測定 成瘤時間、成瘤率（接種后有瘤裸鼠數(shù)/接種裸鼠總數(shù)×100%）及移植瘤的體積增長速率、移植瘤組織切片光鏡（必要時電鏡）觀察組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.2 治療效果觀察 用藥時間每周用游標(biāo)卡尺測量移植瘤長短徑2次，按照標(biāo)準(zhǔn)的公式計算出移植瘤的體積大?。阂浦擦鲶w積（V）=長徑（L）×短徑（W）2×0.52，測量體重2次，繪制體重生長曲線和移植瘤的生長曲線情況。末次給藥后24h，處理全部裸鼠，切除皮下移植瘤，稱重計算瘤重抑制率（%）。瘤重抑制率（%）=（1-處理組平均瘤重/模型對照組平均瘤重）×100%。組織切片HE染色光鏡下觀察移植瘤形態(tài)學(xué)改變。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測技術(shù) 觀察經(jīng)過處理因素處理后，移植瘤的細(xì)胞凋亡情況。

1.3.4 毒副作用的觀察 （1）體重稱量：體重減輕率=（1-處理組去瘤后平均體重/正常裸鼠對照組平均體重）×100%，體重減輕率<20%為可接受治療，≥20%為毒性大，動物不能耐受。（2）血液生化學(xué)的檢測：末次對裸鼠給藥24h后處理裸鼠的前須眼球并予以摘除取血，計數(shù)紅細(xì)胞，進(jìn)行Hb的測定、計數(shù)白細(xì)胞，通過離心方式取血清，測定出血清的乳酸脫氫酶（LDH，可反映出心肌與組織的損傷），血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（γ-GT，反映出肝功能的損傷）、血清肌酐值（Cr，反映出腎功能的損傷）。骨髓像的檢測：必要時可斷裸鼠的骨上端，抽吸其骨髓進(jìn)行涂片觀察。各組取裸鼠三只其的心，肝，脾，肺，腎，腦做HE染色，觀察藥物對裸鼠各大主要臟器及全身各個系統(tǒng)的毒副影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用x2或t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 幾組藥物對宮頸癌抑瘤作用情況比較

觀察組各組的瘤質(zhì)量及細(xì)胞的凋亡率顯著優(yōu)于對照組，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見表1。

2.2 三氧化二砷聯(lián)合順鉑對Hela細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果表明：As2O3可以使體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，在DNA直方圖上可見凋亡峰。

2.3 使用藥物后的不良反應(yīng)

2.3.1 藥物對裸鼠血常規(guī)的影響 觀察組各組藥物治療后出現(xiàn)一定程度上的白細(xì)胞降低，順鉑藥物組出現(xiàn)骨髓抑制明顯；其他血紅蛋白、血小板值較對照組顯著下降。

2.3.2 藥物對裸鼠肝腎功能的影響 用藥后觀察組裸鼠的血尿素氨水平、丙轉(zhuǎn)氨酶值有所升高；順鉑藥物組的肝腎損傷較為明顯，與對照組相比數(shù)值顯著升高。

3 討論

宮頸癌是婦產(chǎn)科最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病的原因尚不明確，但該病的發(fā)病率、死亡率居婦科腫瘤之首，在性生活紊亂、多產(chǎn)、早育、早婚的婦女中具有較高的患病率，宮頸癌危害較大，可引起女性的不孕、影響生理生活、對婦女的子宮造成致命的損傷及還可導(dǎo)致患者身體多個部位的病變，嚴(yán)重的影響了婦女的健康與生活，甚至危及患者的生命[4-5]。目前，臨床的綜合治療主要以手術(shù)及化療為主，而宮頸癌的化療尤其是近年來采取的動脈插管介入治療的化療方式在宮頸癌晚期、復(fù)發(fā)患者和局部巨大腫瘤的術(shù)前化療起著重要的作用，但化療的藥物毒副作用大，尤其是肝腎功能損傷及骨髓抑制，且耐藥性的問題也逐漸增加，影響了臨床化療的效果[6-8]。

本實驗比較不同濃度的三氧化二砷（As2O3）與順鉑單獨或合用對宮頸癌裸鼠移植瘤的療效和毒副作用的觀察，順鉑作為治療宮頸癌比較有效的藥物，其作用的機(jī)理主要是與DNA雙鏈形成交叉連接，導(dǎo)致細(xì)胞G0/G1期的阻滯[9-10]。但它和大多數(shù)抗腫瘤藥物一樣缺少選擇性抑制腫瘤的作用，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時伴有較大的毒性[11]。尤其是肝腎功能損傷及骨髓抑制。因此尋找新的對宮頸癌有效的毒性小的藥物或者利用它們增加已有化療藥物的療效就顯得尤為重要[12]。而三氧化二砷是中藥砒霜的有效成分，其治療急性早幼粒白血病的療效顯著且得到臨床的肯定，近年來也逐漸開始了對實體瘤的研究，該藥物可以抑制細(xì)胞的分裂，屬于長春堿類的一種抗腫瘤藥物，其對腫瘤的治療作用是直接的作用于裸鼠微管蛋白與微管的動態(tài)平衡，可抑制管蛋白的聚合，并崩解分裂期的微管，通過阻斷G2/M期細(xì)胞的有絲分裂，導(dǎo)致進(jìn)入間期或分裂期的細(xì)胞死亡。還可能與下調(diào)端粒酶活性有關(guān)、直接損傷DNA、抑制腫瘤血管形成有關(guān)[13]。有報道三氧化二砷與其他化療藥物交叉耐藥少。對惡性腫瘤細(xì)胞有較高的選擇性[14]。三氧化二砷聯(lián)合順鉑應(yīng)用于治療中，對腫瘤的抑制率顯著優(yōu)于單藥的使用，也大大降低了用藥后的毒副作用。兩種藥物各有所長，互為補(bǔ)充，聯(lián)合應(yīng)用增加了對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，起到了很好的抗腫瘤的效果。

本次研究通過不同劑量的三氧化二砷單獨及聯(lián)合順鉑對人宮頸癌移植瘤的作用及機(jī)制，經(jīng)研究結(jié)果顯示：觀察組各組的瘤質(zhì)量及細(xì)胞的凋亡率顯著優(yōu)于對照組，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。觀察組各組藥物治療后出現(xiàn)一定程度上的白細(xì)胞降低，順鉑藥物組出現(xiàn)骨髓抑制明顯；其他血紅蛋白、血小板值較對照組顯著下降；用藥后觀察組裸鼠的血尿素氨水平、丙轉(zhuǎn)氨酶值有所升高；順鉑藥物組的肝腎損傷較為明顯，與對照組相比數(shù)值顯著升高。

綜上所述，三氧化二砷聯(lián)合順鉑治療宮頸癌移植瘤，有效的促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)了抑制癌細(xì)胞增殖的作用，減少了藥療后毒副作用的發(fā)生，防止或延緩了耐藥性的產(chǎn)生，促進(jìn)了臨床的治療效果，臨床效果顯著，值得推廣。

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（收稿日期：2014-10-07）