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    三氧化二砷對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖和凋亡的影響

    2020-05-12 09:26:10張衛(wèi)華劉思源華長城
    健康研究 2020年2期
    關(guān)鍵詞:三氧化二砷細(xì)胞周期培養(yǎng)基

    張衛(wèi)華, 劉思源, 華長城

    (1.永康市第一人民醫(yī)院 手外科,浙江 永康 321300; 2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 骨與軟組織腫瘤科,河北 石家莊 050051;3.亳州市人民醫(yī)院 骨科,安徽 亳州236800)

    骨肉瘤在骨科惡性腫瘤中較為常見。骨肉瘤常用化療藥物包括氨甲喋呤、順鉑、阿霉素及異環(huán)磷酰胺等。骨肉瘤患者常對化療藥物耐藥,放化療效果欠佳,預(yù)后較差[1]。三氧化二砷是中藥砒霜的有效成分,我國學(xué)者應(yīng)用砷劑治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL),療效顯著[2]。目前國內(nèi)外對三氧化二砷治療骨肉瘤的研究較少,本研究旨在探討三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO)對人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的作用,以期對臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

    1 材料和方法

    1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司,二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶-EDTA消化液購自北京索萊寶生物科技有限公司,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司,增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、Caspase-3酶原抗體及CyclinE均購自武漢博士德生物工程有限公司,Bax、Bcl-2、CyclinD1均購自SANTA公司,三氧化二砷購自哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字:H19990191)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63為河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心凍存品。以含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2~3 d傳代1次,取對數(shù)期生長細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.3 光鏡觀察 將MG-63細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁生長至對數(shù)生長期,分成對照組(不含藥物培養(yǎng)基)及實(shí)驗(yàn)組(含8 μmol/L ATO培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng),每組設(shè)3個復(fù)孔,置于倒置相差顯微鏡下,于24 h及36 h照相觀察其形態(tài)變化。

    1.4 MTT法 取對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,將細(xì)胞調(diào)整為1.0×104/ mL,接種于96孔板,培養(yǎng)6~8 h,待細(xì)胞貼壁后用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)置對照組(不含藥培養(yǎng)基),含不同濃度ATO組(10、8、6、4 μmol/L)。每組設(shè)5個復(fù)孔,分別培養(yǎng)24、36、48、60 h后,每孔加入MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO,37℃放置10~20 min,采用酶標(biāo)儀(波長570 nm)測量吸光度,細(xì)胞生長抑制率(%)=[1-(A加藥-A空白)/(A對照-A空白)]×100%。

    1.5 流式細(xì)胞術(shù) 將MG-63細(xì)胞接種在25 mL培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞長到80%融合,更換含不同濃度藥物的培養(yǎng)基作用36 h,每組3瓶。收集細(xì)胞,PBS洗滌,冰預(yù)冷的70%乙醇固定、離心,加入碘化丙啶室溫避光染色30 min, 用Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布。

    1.6 蛋白印跡法 MG-63細(xì)胞經(jīng)藥物作用36 h后,收集細(xì)胞,每瓶細(xì)胞加100L含PMSF的裂解液(50 mmol/L Tris-Hcl pH7.4,1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L Nacl, 1 mmol/L PMSF),于冰上裂解30 min后,4℃ 12 000 rpm,離心半徑10 cm 離心5 min。取上清移于-20℃保存。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。含10%小牛血清的TBST室溫下封閉1 h后,加入1.5%BSA稀釋的一抗PCNA(1∶500)、Cyclin D1(1∶200)、Cyclin E(1∶500)、Bcl-2(1∶200)、Bax (1∶1 000)、Caspase-3(1∶500)孵育過夜。TBST緩沖液洗4次后,加入1.5%BSA稀釋的二抗(1∶5 000),孵育1 h。TBST洗4次,ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)2 min,檢測條帶并照相、分析、保存。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 三氧化二砷對細(xì)胞形態(tài)的影響 8 mol/L 三氧化二砷處理MG-63細(xì)胞24 h、36 h,細(xì)胞貼附能力減弱、漂浮細(xì)胞增多,并出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、體積變小、胞質(zhì)濃縮,最后破裂凋亡等變化。對照組細(xì)胞數(shù)量多而完整、完全貼壁、胞質(zhì)均勻、狀態(tài)良好、無細(xì)胞破裂。見圖1。

    2.2 三氧化二砷對MG-63細(xì)胞生長的抑制作用 三氧化二砷可抑制MG-63細(xì)胞的生長,其效果與時間和濃度相關(guān),見表1。三氧化二砷對MG-63細(xì)胞24、36、48、60 h的IC50分別為12.12、9.29、7.59、6.96 μmol/L。

    表1 三氧化二砷對MG-63細(xì)胞生長的抑制作用

    A.對照組;B.8 μmol/L三氧化二砷,24 h; C.8 μmol/L三氧化二砷, 36 h

    圖1 倒置顯微鏡觀察三氧化二砷作用下MG-63細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×100)

    2.3 三氧化二砷對MG-63細(xì)胞周期的影響 與對照組G0/G1期細(xì)胞比例(32.92±2.01)比較,4 μmol/L三氧化二砷組(12.53 ±1.18)、6 μmol/L三氧化二砷組(2.66±0.44)、8 μmol/L三氧化二砷組(15.13±0.71)、10 μmol/L三氧化二砷組(9.15±0.73)的G0/G1期細(xì)胞比例均減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組S期細(xì)胞比例(42.45±1.44)比較,4 μmol/L三氧化二砷組(74.42±1.06)、6 μmol/L三氧化二砷組(72.93±1.07)、8 μmol/L三氧化二砷組(52.36±2.33)、10 μmol/L三氧化二砷組(81.48±1.56)的S期細(xì)胞比例均增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

    2.4 三氧化二砷對MG-63細(xì)胞凋亡的影響 與對照組凋亡率(1.30±0.31)比較,4 μmol/L三氧化二砷組(2.79±0.22)、6 μmol/L三氧化二砷組(13.60±0.91)、8 μmol/L三氧化二砷組(9.58±0.84)、10 μmol/L三氧化二砷組(9.46±1.34)的凋亡率均增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);三氧化二砷作用后各組細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡峰。見圖2。

    A.對照組;B.4 μmol/L三氧化二砷; C.6 μmol/L三氧化二砷; D.8 μmol/L三氧化二砷; E. 10 μmol/L三氧化二砷。

    2.5 三氧化二砷對MG-63細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,8 μmol/L 三氧化二砷組處理36 h后的PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和Bcl-2蛋白表達(dá)降低,Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    *與control組比較,P<0.05。

    3 討論

    骨肉瘤患者常存在肉眼難以察覺的細(xì)小轉(zhuǎn)移灶,單純手術(shù)不能解決所有問題[3-5]。骨肉瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),一般預(yù)后較差[6]。新輔助化療理念是術(shù)前化療+手術(shù)+術(shù)后化療,強(qiáng)調(diào)術(shù)前化療6~10周使腫瘤局限,可使部分骨肉瘤患者實(shí)現(xiàn)保肢治療[7-8]。篩選有效的骨肉瘤化療藥物對于實(shí)施新輔助化療非常關(guān)鍵。

    Chen等[9]研究表明,三氧化二砷可誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡和部分分化。大量研究表明[10-12],除了對血液系統(tǒng)惡性腫瘤具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用外,三氧化二砷對其他系統(tǒng)腫瘤也具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。郭衛(wèi)等[13]研究發(fā)現(xiàn),三氧化二砷對Ⅲ期骨肉瘤、尤文肉瘤患者有較好的近期臨床療效。本研究結(jié)果表明,三氧化二砷對MG-63細(xì)胞的生長抑制具有劑量-時間效應(yīng)。Cyclin蛋白通過調(diào)節(jié)相應(yīng)的CDKS組成蛋白激酶復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的復(fù)制和增殖。Cyclin D在細(xì)胞周期中屬正性調(diào)節(jié)因子,過度的表達(dá)可激活CDK-4,促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。細(xì)胞增殖的基因擴(kuò)增引起Cyclin E蛋白表達(dá)增強(qiáng)[15]。Cyclin D調(diào)節(jié)G1進(jìn)展,Cyclin E是實(shí)現(xiàn)G1/S轉(zhuǎn)換。本研究結(jié)果顯示,三氧化二砷將MG-63細(xì)胞阻滯于S期,提示三氧化二砷能干擾MG-63細(xì)胞的DNA合成及有絲分裂。

    PCNA是細(xì)胞DNA合成所需蛋白,其表達(dá)、合成與細(xì)胞周期關(guān)系密切。PCNA在G1期合成增加,S期達(dá)到高峰。PCNA常作為測定細(xì)胞增殖水平的指標(biāo),PCNA表達(dá)減少,表明細(xì)胞增殖受到抑制。Bcl-2家族是目前研究較多的凋亡相關(guān)基因家族,Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族, Bax/Bcl-2比值升高說明促進(jìn)細(xì)胞凋亡,Bax/Bcl-2比值降低說明抑制細(xì)胞凋亡。Caspase家族是實(shí)現(xiàn)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白,Caspase3處于Caspase家族完成細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的中心位置,是最主要的終末剪切酶,受上下游蛋白酶的調(diào)控。Caspase3表達(dá)增強(qiáng),說明促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,三氧化二砷下調(diào)MG-63細(xì)胞的PCNA、CyclinD1、CyclinE和Bcl-2蛋白表達(dá),上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。

    綜上所述,三氧化二砷對體外MG-63細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用,能下調(diào)PCNA、CyclinD、CyclinE和Bcl-2蛋白表達(dá),上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。

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