骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠重癥急性胰腺炎中的作用

王建祥,王 平,吳海龍,劉 峰,周 銳

(華中科技大學(xué) 附屬普愛(ài)醫(yī)院 普外科,湖北 武漢 430033)

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種嚴(yán)重的全身性疾病,該病早期即可引起肺臟,肝臟等多功能器官衰竭。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCS)是一種具有自我修復(fù)和多向分化潛能的原始細(xì)胞。近年許多研究表明MSCS可分化為成熟的肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等[1-3]。MSCS還可以通過(guò)表達(dá)不同的表面分子,行使免疫調(diào)節(jié)功能。目前利用MSCS極強(qiáng)的分化能力,將它用于缺血性心臟病、心肌梗死等疾病的治療[4-5],顯示了MSCS在臨床應(yīng)用中的巨大潛能。但將其用于胰腺炎領(lǐng)域的研究還處于初級(jí)階段,本實(shí)驗(yàn)擬向 SAP模型大鼠體內(nèi)移植異體 MSCS,來(lái)驗(yàn)證 MSCS是否能抑制炎癥因子的釋放,從而緩解炎癥反應(yīng)。

1 材 料

雨蛙素(caerulein)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),Sigma公司;LPS胎牛血清,杭州四季青生物研究所;DMEM培養(yǎng)基,Gibco公司;Hoechst33258貯存液,上海化學(xué)試劑公司;TNF-α,IL-6放免分析測(cè)定試劑盒,北京東雅生物技術(shù)研究所。

成年健康 SD大鼠 114只,清潔級(jí),體重 180～220 g,雌雄各半,湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(鄂)2006-0005。

2 方 法

2.1 大鼠 MSCS的分離、原代和傳代培養(yǎng)

引頸法處死 SD大鼠,取出大鼠股骨和脛骨,沖出骨髓細(xì)胞,用Piltenger法[6]收集細(xì)胞,全骨髓貼壁接種于25 cm2培養(yǎng)瓶,每3 d換一次培養(yǎng)液,4～6 d細(xì)胞約90%融合,按 1∶2或 1∶3比例傳代培養(yǎng)。

2.2 大鼠 MSCS標(biāo)記率檢測(cè)

P3代 MSCS待其生長(zhǎng)融合80%左右,加入Hoechst33258貯存液,使 Hoechst33258終濃度為10 μg/L,放入37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育15 min。取細(xì)胞懸液滴到載玻片下用熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)較多圓形黃綠色熒光顆粒則表示標(biāo)記成功。

2.3 大鼠 SAP模型制備

將 SD大鼠隨機(jī)分為4組:A組為空白對(duì)照組6只(未作任何處理);B組為單純注射 MSCS組36只;C組為胰腺炎組36只。將用生理鹽水配制的雨蛙素溶液按 20μg/kg注射至大鼠腹腔,連續(xù) 6次,每次間隔 1 h,最后一次注射雨蛙素的同時(shí)注射 LPS溶液10mg/kg;D組為治療組36只,將雨蛙素溶液20μg/kg注射至大鼠腹腔,連續(xù) 6次,每次間隔 1 h,最后一次注射雨蛙素的同時(shí)注射 LPS溶液,注射LPS完畢后立刻于尾靜脈注射標(biāo)記的MSCS生理鹽水懸液1mL(細(xì)胞密度 1×106/mL)。

2.4 組織化學(xué)檢測(cè)

2.4.1 大鼠血漿中 TNF-α、IL-6的檢測(cè) 分別取注射細(xì)胞后0.5,2,4,6,12 h下腔靜脈血液4～5mL置于離心管中,分離血漿,集中用ELISA試劑盒檢測(cè)血漿中 TNF-α、IL-6的濃度。

2.4.2 組織學(xué)檢測(cè) 取出各大鼠胰腺,將一部分標(biāo)本做石蠟切片,另外一部分做冰凍切片。取右肺下葉制作石蠟切片,右肺上葉制作冰凍切片。

2.4.3 大鼠肺的濕/干重比值 統(tǒng)一取試驗(yàn)開(kāi)始后6 h大鼠左肺,稱量濕重,放置70℃恒溫烤箱烘烤72 h至恒重,稱量干重。計(jì)算濕/干重比值。

2.5 切片熒光判定

切片中未見(jiàn)熒光:-;切片中偶見(jiàn)熒光(單個(gè)視野內(nèi)可見(jiàn)熒光細(xì)胞數(shù)≤5):±;可見(jiàn)散在熒光細(xì)胞(每個(gè)視野內(nèi)可見(jiàn)熒光細(xì)胞數(shù)≤10):﹢;可見(jiàn)較多熒光細(xì)胞(每個(gè)視野可以見(jiàn)熒光細(xì)胞數(shù)≤20):﹢﹢;可見(jiàn)大量熒光細(xì)胞(每個(gè)視野可以見(jiàn)熒光細(xì)胞數(shù)≥20):﹢﹢﹢;可見(jiàn)成團(tuán)熒光細(xì)胞:﹢﹢﹢﹢。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)情況及鑒定

至第3代時(shí),倒置相差顯微鏡下觀察 MSCS,細(xì)胞基本呈均一的梭形。流式細(xì)胞儀示大鼠 MSCS為CD34-,CD44+,CD90+,陽(yáng)性率分別為0.04%,90.81%,95.53%。

3.2 大鼠死亡情況

A、B組中均無(wú)大鼠死亡;C組12 h全部存活,24 h存活 2只,48 h內(nèi)全部死亡;D組12 h全部存活,24 h后4只存活,48 h后3只存活,72 h后2只存活。

3.3 肺的濕 /干重比值

結(jié)果見(jiàn)表1。大鼠注射 MSCS細(xì)胞對(duì)大鼠肺臟無(wú)明顯損傷;聯(lián)合注射雨蛙素和LPS后,大鼠造成SPA后并且導(dǎo)致肺損傷;聯(lián)合注射雨蛙素和LPS,同時(shí)注射 MSCS可以減輕 SPA導(dǎo)致的肺損傷。

表1 大鼠造模后6h大鼠肺濕/干重比(±s)Tab.1 Changes of lung wet dry ratio in each group of rats at 6 h(±s)

表1 大鼠造模后6h大鼠肺濕/干重比(±s)Tab.1 Changes of lung wet dry ratio in each group of rats at 6 h(±s)

與A組比較:1 P＜0.01;與C組比較:2 P＜0.01Compared with group A:1P＜0.01;Compared with group C:2 P＜0.01

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3.4 大鼠血漿中 TNF-α,IL-6的濃度變化

結(jié)果見(jiàn)表2～3。單純注射 MSCS并不會(huì)引起血漿中炎癥因子 TNF-α、IL-6的升高,聯(lián)合注射雨蛙素和LPS后可導(dǎo)致血漿中炎癥因子 TNF-α、IL-6顯著升高。注射雨蛙素和LPS后立即注射 MSCS可顯著降低血漿中炎癥因子 TNF-α、IL-6水平。

3.5 胰腺和肺病理改變

3.5.1 胰腺組織病理變化A組和B組胰腺間質(zhì)無(wú)明顯改變,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)壞死灶。C組大體觀,胰腺高度水腫,表面有許多出血點(diǎn);鏡下胰腺間質(zhì)內(nèi)動(dòng)脈痙攣,靜脈明顯擴(kuò)張淤血,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腺泡呈孤島狀,廣泛腺細(xì)胞壞死,細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清(圖1)。D組大體觀,胰腺仍充血水腫,但程度較 C組輕,表面出血點(diǎn)也較少;鏡下胰腺間質(zhì)充血水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)比 C組輕,有少量局灶性壞死,血管病變較 C組明顯減輕(圖2)。

表2 SAP中各組大鼠血漿中的TNF-α變化(±s)Tab.2 Changes of plasma TNF-αin each group rats(±s)

表2 SAP中各組大鼠血漿中的TNF-α變化(±s)Tab.2 Changes of plasma TNF-αin each group rats(±s)

與A組比較:1 P＜0.01,2 P＜0.05;與C組比較:3P＜0.05Compared with group A:1P＜0.01,2P＜0.05;Compared with group C:3P＜0.05

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表3 SAP中各組大鼠血漿中的IL-6變化(±s)Tab.3 Changes of plasma IL-6 in each group of rats(±s)

表3 SAP中各組大鼠血漿中的IL-6變化(±s)Tab.3 Changes of plasma IL-6 in each group of rats(±s)

與A組比較:1 P＜0.01,2 P＜0.05;與C組比較:3P＜0.05,4P＜0.01Compared with group A:1P＜0.01,2P＜0.05;Compared with group C:3P＜0.05,4P＜0.01

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圖1 C組SAP胰腺 6h病理變化Fig.1 The pathological changes of pancreas in Cgroup at 6 h

圖2 D組SAP胰腺 6 h病理變化Fig.2 The pathological change of pancreas in D group at 6 h

3.5.2 肺組織的病理改變 A組和B組肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡上皮形態(tài)正常,肺泡間隔未見(jiàn)增寬,肺泡間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)水腫,出血和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。C組肺表面有少量出血點(diǎn);鏡下肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞,肺泡壁毛細(xì)血管彌漫性擴(kuò)張充血;肺泡間隔明顯增寬,肺間質(zhì)明顯水腫,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。D組肺表面未見(jiàn)明顯出血點(diǎn)。鏡下絕大部分肺泡壁結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁毛細(xì)血管輕度充血。肺泡間隔增寬較 C組輕,肺間質(zhì)輕度水腫,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)。

圖3 C組6 h肺組織病理變化Fig.3 The pathological changes of lungs in C group at 6 h

圖4 D組6 h肺組織病理變化Fig.4 The pathological changes of lungs in D group at 6h

3.6 MSCS在胰腺和肺組織中的分布差異

結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)照組MSCS在胰腺、肺和肝臟組織中的分布無(wú)明顯差異,D組MSCS在0.5 h在各組織分布無(wú)明顯差異,從2 h開(kāi)始可見(jiàn)明顯分布差異,其中胰腺組織較多,肺組織其次,肝臟組織較少。D組與B組相比,D組胰腺和肺熒光細(xì)胞均數(shù)比同時(shí)間點(diǎn) B組熒光細(xì)胞數(shù)多;而D組和B組肝臟內(nèi)熒光細(xì)胞數(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)比,差別不明顯。死亡的大鼠體同 D組2 h以后相比,胰腺、肺和肝臟內(nèi)熒光細(xì)胞數(shù)均較 D組存活的大鼠這些臟器內(nèi)的熒光細(xì)胞數(shù)要少。

表4 D組不同時(shí)間點(diǎn)各器官中的MSCS分布情況Tab.4 The difference of distribution of stained MSCS at different time points

3.7 MSCS的分化情況

將 D組存活至72 h的SD大鼠肺和胰腺組織行HE染色,與B組SD大鼠72 h肺組織和胰腺組織對(duì)比,發(fā)現(xiàn)破損胰腺腺泡和肺泡壁細(xì)胞未見(jiàn)明顯修復(fù)和再生。與B組24,48 h時(shí)肺組織肺泡壁和胰腺腺泡細(xì)胞相比也未見(jiàn)明顯修復(fù)和再生。

4 討 論

在SAP發(fā)病過(guò)程中,TNF-α和IL-6作為炎癥介質(zhì)有強(qiáng)烈的致炎活性[7],并且TNF-α作為SAP始動(dòng)因子的作用已有研究證實(shí)[8]。

MSCS是存在于骨髓中不同于造血干細(xì)胞的一類組織干細(xì)胞,具有極強(qiáng)的可塑性,MSCS免疫原性較小,屬于未分化的前體干細(xì)胞,因此MSCS移植同種異體后無(wú)排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱。

本研究結(jié)果顯示,聯(lián)合注射雨蛙素和LPS后大鼠體內(nèi) TNF-α、IL-6各時(shí)間點(diǎn)水平均比空白對(duì)照明顯升高(P＜0.01),高峰分別出現(xiàn)在注射后2和6 h。同時(shí)病理切片觀察發(fā)現(xiàn)胰腺和肺組織發(fā)生充血水腫,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等明顯改變。而治療組在注射 MSCS后血漿各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6水平較單純 SAP組顯著降低(P＜0.01),同時(shí)胰腺和肺組織損傷及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。表明MSCS移植對(duì)SAP早期損傷具有保護(hù)作用。

MSCS移植后能減輕大鼠 SAP炎癥反應(yīng),降低血漿中 TNF-α、IL-6的水平具體機(jī)理尚不清楚。MSCS表面具有 TNF-α、IL-6受體,通過(guò)與TNF-α、IL-6的直接結(jié)合可能是降低其水平的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)中熒光 MSCS在健康大鼠各組織中的分布無(wú)明顯差異,而在SAP受損部位則有明顯聚集,且一定程度上與損傷程度成正相關(guān)。研究表明在機(jī)體受損情況下MSCS有類似白細(xì)胞向損傷部位定向趨化移動(dòng)能力。通過(guò)對(duì)比死亡和存活大鼠不同組織中MSCS的分布情況,可發(fā)現(xiàn) SAP死亡大鼠胰腺和肺組織內(nèi) MSCS含量明顯少于存活大鼠的含量,這可能與SAP損傷過(guò)重,組織毛細(xì)血管痙攣壞死導(dǎo)致血供不足,阻止了MSCS移動(dòng)有關(guān)。

Neil等[9]研究發(fā)現(xiàn)放射性肺炎大鼠模型移植MSCS后,肺損傷減輕,從第7天開(kāi)始 MSCS分化為肺泡Ⅱ細(xì)胞,但轉(zhuǎn)化率較低。Tomita等[10]分離培養(yǎng)大鼠骨髓 MSCS,經(jīng)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)后移植入自體心肌冷凍損傷所得瘢痕組織中心,5周后表達(dá)肌鈣蛋白I和肌球蛋白重鏈,表明 MSCS向心肌細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)大鼠 SAP移植 MSCS后72 h肺組織和胰腺組織均未見(jiàn)明顯再生細(xì)胞。表明 MSCS可以通過(guò)分化之外的另一機(jī)制參與炎癥反應(yīng),即與細(xì)胞因子相互作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。該機(jī)制可能在減輕SAP早期損傷中起重要作用。

MSCS對(duì)大鼠 SAP的作用機(jī)制較為復(fù)雜,既有免疫調(diào)節(jié)作用,還可能有橫向分化為受損組織進(jìn)行修復(fù)作用。本研究表明,在SAP早期可能以免疫調(diào)節(jié)為主,因?yàn)闀r(shí)間原因?qū)τ诤笃诘姆只迯?fù)作用未能深入研究。隨著對(duì)分化調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、歸巢分子機(jī)制等研究的深入以及更多的大規(guī)模的研究,MSCS在SAP臨床應(yīng)用中有著廣闊前景。

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