桉葉油毒性及其對環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓微核及精子畸形的保護(hù)作用

余永莉，王傳銅，馮國紋，唐于川，趙晟珣，王 霞，蘭美兵，李嘯紅

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)人體解剖與組織胚胎教研室，廣東珠海 519041)

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)是臨床上常用的氮芥類的抗腫瘤藥物，進(jìn)入人體后在肝臟或血液中經(jīng)活化生成烷基化的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用，其主要的不良反應(yīng)是嚴(yán)重?fù)p傷骨髓細(xì)胞的造血功能，引起白細(xì)胞減少以及導(dǎo)致感染等嚴(yán)重后果，影響治療效果。同時(shí)它也是一種誘變劑 ，可明顯誘發(fā)骨髓細(xì)胞微核和姐妹染色單體互換，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中它常用作研究遺傳毒性和生殖毒性實(shí)驗(yàn)陽性對照組模型的造模劑。因此，尋找對于CP所致?lián)p傷具有防護(hù)作用的物質(zhì)，對于臨床上減輕使用CP進(jìn)行治療的患者的不良反應(yīng)具有重要意義。對于保護(hù)職業(yè)性接觸這種化學(xué)物質(zhì)的人群也有一定意義。

桉葉是民間常用的草藥。桉葉可提取桉葉油(eucalyptus)，主要化學(xué)成分是萜類、萜醇、醚、酮類和酯等含氧化合物［1］，氣味芳香，具有揮發(fā)性。是醫(yī)藥、香料和化學(xué)工業(yè)的重要原料，也是常用的食品添加劑。其藥理作用有抗菌［2－4］、抗氧化［5－8］、抗炎［9］、促滲［10－11］、殺蟲驅(qū)蚊［12－15］及防腐。隨著桉葉油在抑菌殺蟲方面的研究和應(yīng)用越來越深入，對于桉葉油的生物活性機(jī)制研究也引起了普遍重視。本研究用桉葉油ig給予小鼠，研究桉葉油的遺傳毒性及其對CP所致小鼠的遺傳毒性是否有保護(hù)作用，為其作為食品添加劑、香料利用，或藥品開發(fā)提供一些遺傳毒性方面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號:SCXK(粵)2007-0002。飼養(yǎng)條件:室溫為24～27℃，通風(fēng)，相對濕度為68% ～80%，每日光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥品及試劑

桉葉油(桉葉素99.5%)購自德信行(珠海)香精香料有限公司，批號H071126。CP購自山西普德藥業(yè)有限公司，批號08061521。

1.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 測定桉葉油對小鼠的半數(shù)致死量

小鼠50只，體重18～23 g，隨機(jī)分成5組，雌雄各半。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各組小鼠分別ig給予桉葉油1700，1750，1800，1850 和1900 mg·kg－1。觀察并記錄2周動(dòng)物的死亡情況。利用SPSS13.0計(jì)算LD50和95%的可信區(qū)間。

1.3.2 骨髓微核實(shí)驗(yàn)測定桉葉油對小鼠微核率的影響

另取小鼠50只，體重18～23 g，隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半。其中，桉葉油400，200和100 mg·kg－1組，以及溶劑對照組(花生油0.4 ml)和陽性對照組(CP)。桉葉油組小鼠每天ig給予1次，連續(xù)5 d。陽性對照組于處死前2 d開始ip給予CP 40 mg·kg－1，每天1次。各組于末次用藥2 h后脫頸椎處死，每只小鼠取其兩側(cè)股骨骨髓，按李嘯紅等［16］實(shí)驗(yàn)方法制片。細(xì)胞涂片置顯微鏡油鏡下觀察，每只小鼠骨髓涂片計(jì)數(shù)1000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞，微核率以含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)的千分率計(jì)。每組微核率比值采用單因素方差分析，SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.3.3 精子畸形實(shí)驗(yàn)測定桉葉油對小鼠精子畸形率的影響

昆明種小鼠，雄性30只，20～25 g，隨機(jī)分為5組，每組6只。各組用藥劑量同微核實(shí)驗(yàn)。受試藥物組及陰性對照組小鼠每天ig給予1次，陽性對照組ip給予CP 40 mg·kg－1，每天1 次，連續(xù)5 d。各組小鼠于第一次給藥后35 d，脫頸椎處死，取出其雙側(cè)附睪放入盛有生理鹽水的離心管中，按胡怡秀等［17］方法制片、鏡檢。每只小鼠觀察1000個(gè)精子，記錄畸形(鐮刀形、雙尾、胖頭、無鉤和無定形等)數(shù)目并統(tǒng)計(jì)畸形率(‰)。

1.4 桉葉油的保護(hù)作用

1.4.1 小鼠骨髓微核率的測定

小鼠50只，雌雄各半，18～23 g，隨機(jī)分成5組，每組10只。其中桉葉油100，200和400 mg·kg－1組，花生油(溶劑對照)0.4 ml和 CP 40 mg·kg－1(陽性對照)組。桉葉油組與溶劑對照組小鼠每天上午9時(shí)ig給藥，連續(xù)5 d，在處死前2 d各組與陽性對照組一起ip給予CP 40 mg·kg－1，每天1次。第5天末次給藥2 h后脫頸椎處死小鼠取骨髓細(xì)胞涂片，進(jìn)行骨髓嗜多染紅細(xì)胞中的微核計(jì)數(shù)。

1.4.2 小鼠精子畸形率的測定

雄性昆明種小鼠，30只，體重20～25 g，隨機(jī)分為5組，每組6只。各組用藥劑量同1.4.1。桉葉油組及溶劑對照組小鼠每天ig 1次，連續(xù)10 d，第6天起與陽性對照組一起每天ip給予CP 1次，連續(xù)5 d。各組小鼠于第一次注射CP后35 d，脫頸椎處死，取精子觀察精子畸形率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 桉葉油急性毒性

小鼠ig給予桉葉油后，小鼠精神萎靡，活動(dòng)量少，飲食量少。但桉葉油≤1800 mg·kg－1組2～3 d后活動(dòng)、飲食恢復(fù)常態(tài)。小鼠ig給予桉葉油1700～1900 mg·kg－1后，桉葉油的 LD50為 1824.01 mg·kg－1，95%可信限為 1799.48 ～1851.19 mg·kg－1。

小鼠ig給予桉葉油400，200和100 mg·kg－15 d后，骨髓嗜多染紅細(xì)胞中的微核率分別為0，(0.1 ±0.3)‰，(0.2 ±0.6)‰，與溶劑對照組比較無顯著差異，但明顯低于陽性對照組(17.8±4.6)‰(P＜0.05)，提示桉葉油對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞數(shù)微核率無明顯影響。

雄小鼠 ig給予桉葉油 400，200 和 100 mg·kg－15 d后，精子畸變率分別為(3.7 ±1.6)‰，(3.5 ±1.5)‰和(6.5 ±2.5)‰，與溶劑對照組(6.8 ±2.8)‰比較無顯著性差異，但明顯低于CP(陽性對照)組精子畸變率(67±26.4)‰(P ＜0.05)，提示桉葉油對小鼠精子畸形無明顯影響。

2.2 桉葉油對環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓微核率及精子畸形率的影響

小鼠預(yù)先ig給予桉葉油100，200 和400 mg·kg－1，CP誘發(fā)小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞中的微核率分別為(10.7 ±4.1)‰，(7.3 ±4.3)‰，(9.0 ±2.6)‰，明顯低于陽性對照CP誘發(fā)的微核率(18.5±5.6)‰(P＜0.05)，但花生油(溶劑組)(17.5 ±3.3)‰無此作用(表1)，提示桉葉油可降低CP誘發(fā)的小鼠骨髓微核率，花生油無此作用。

表1 桉葉油對環(huán)磷酰胺誘發(fā)骨髓嗜多染細(xì)胞微核率的影響Tab.1 Effect of eucalyptus on micronucleus of bone narrow induced by cyclophosphamide in mice

小鼠 ig給予桉葉油400，200和100 mg·kg－110 d后，CP誘發(fā)小鼠精子畸形率分別為(37.2±22.7)‰，(31.3 ±24.3)‰和(46 ±14.9)‰，明顯低于陽性對照CP所致小鼠精子畸形率(67±26.37)‰(P ＜0.05)，但 ig 給予花生油(17.5 ±3.3)‰無此作用(表2)。提示桉葉油可降低CP致小鼠精子畸形率，花生油無此作用。

表2 桉葉油對環(huán)磷酰胺誘發(fā)精子畸形率的影響Tab.2 Effect of eucalyptus on sperm malformation rate induced by cyclophosphamide in mice

3 討論

桉葉油可以抑制炎癥早期血管通透性的增強(qiáng)，滲出和水腫，抑制前列腺素(PG)合成、釋放或其致炎作用，阻止組胺從 RBL-2H3細(xì)胞中釋放、消除氧自由基改善炎癥癥狀。通過激活紅細(xì)胞中的過氧化氫酶起到抗過氧化作用［18－19］。

隨著桉葉油研究的不斷深入，其應(yīng)用也越來越廣泛，醫(yī)藥用桉葉油主要以富含1，8-桉葉油素的精油為主 ，分離提純1，8-桉葉油素可以治療流感 、感冒、細(xì)菌性痢疾和腸炎等各種感染。在口腔醫(yī)學(xué)中可用作口腔清潔劑的除臭組分。1，8-桉葉油素還有抑制食欲的作用，用它配制的水劑和藥片，對治療食欲亢進(jìn)和減肥，有很好的效果［19－20］。桉葉油在食品中最高參考量為軟飲料含 1.7 mg·kg－1;冷飲含0.5～50 mg·kg－1;酒類含1.0 mg·kg－1;焙烤食品含76 mg·kg－1。本實(shí)驗(yàn)采取桉葉油100，200 和 400 mg·kg－1的劑量，均大于規(guī)定的范圍。且本研究結(jié)果顯示，桉葉油400 mg·kg－1ig給予小鼠5 d，小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率與溶劑對照組比較無明顯的差異，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中桉葉油400 mg·kg－1ig給予成年小鼠2周，小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率與溶劑對照組比較也無明顯的差異，提示桉葉油無誘發(fā)微核和精子畸形的遺傳毒性。但預(yù)先給予桉葉油的小鼠對CP所致的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率較未服用桉葉油組有明顯下降(P＜0.05)。提示桉葉油具有拮抗CP誘發(fā)的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率升高的作用。桉葉油的這一作用對降低臨床用CP化療患者的藥物副作用的影響，具有一定的意義，而其確切的作用機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。

［1］宋立人.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:1670.

［2］Ramezani H，Singh HP，Batish DR，Kohli RK.Antifungal activity of the volatile oil of Eucalyptus citriodora［J］.Fitoterapia，2002，73(3):261-262.

［3］Burt S.Essential oils:their antibacterial properties and potential applications in foods-a review［J］.Int J Food Microbiol，2004，94(3):223-253.

［4］Cimanga K，Kambu K，Tona L，Apers S，De Bruyne T，Hermans N，et al.Correlation between chemical composition and antibacterial activity of essential oils of some aromatic medicinal plants growing in the Democratic Republic of Congo［J］.J Ethnopharmacol，2002，79(2):213-220.

［5］Grassmann J，Hippeli S，Dornisch K，Rohnert U，Beuscher N，Elstner EF.Antioxidant properties of essential oils.Possible explanations for their anti-inflammatory effects［J］.Arzneimittelforsch，2000，50(2):135-139.

［6］Silva J，Abebe W，Sousa SM，Duarte VG，Machado MI，Matos FJ.Analgesic and anti－ inflammatory effects of essential oils of Eucalyptus［J］.J Ethnopharmacol，2003，89(2-3):277-283.

［7］El-Ghorab AH，El-Massry KF，Marx F，F(xiàn)adel HM.Antioxidant activity of Egyptian Eucalyptus camaldulensis var.brevirostris leaf extracts［J］.Nahrung，2003，47(1):41-45.

［8］DessíMA，Deiana M，Rosa A，Piredda M，Cottiglia F，Bonsignore L，et al.Antioxidant activity of extracts from plants growing in Sardinia［J］.Phytother Res，2001，15(6):511-518.

［9］呂小琴，唐法娣，王 硯，趙 婷，卞如濂.藍(lán)桉油對脂多糖引起的大鼠慢性支氣管炎及黏蛋白高分泌的影響［J］.中國中藥雜志，2004，29(2):168-171.

［10］陳彩蓮，姚梅坤.桉葉油和氮酮促透作用比較［J］.武警醫(yī)學(xué)，2001，12(3):171-172.

［11］江 川，黃玉芳，姚梅坤，陳金通，陳荔貞，韓雅峰.桉葉油和氮酮對替硝唑凝膠劑體外透皮釋藥的研究［J］.海峽藥學(xué)，2003，15(1):18-19.

［12］李建華，周敏君，裘學(xué)麗.桉葉油霜抗蠕形螨的療效觀察［J］.中國人獸共患病雜志，2001，17(3):98.

［13］嚴(yán)敖金，譚青安.桉葉精油對三種天牛的忌避效果［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，22(1):87-90.

［14］趙亞娥，郭 娜，李 琛，李小其.桉葉油對兩種蠕形螨的體外殺蟲作用［J］.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2006，17(6):461-464.

［15］李建華，周敏君，郎書源，裘學(xué)麗.桉葉揮發(fā)油對幾種寄生蟲驅(qū)殺作用的研究［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，25(4):362-365.

［16］李嘯紅，楊 柳，姬可平，路權(quán)云，王 強(qiáng)，黃繼鋒.中藥紫草的遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國生育健康雜志，2003，14(3):167-169.

［17］胡怡秀，劉秀英，易傳祝，馬 征，胡春生，尹 進(jìn).苦瓜水提取物對小鼠的急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，9(2):101-104.

［18］田玉紅，張祥民，黃泰松，李桂湘，鄒克興，周 俊.桉葉油的研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(10):139-143.

［19］何耀松，張繼東.桉樹化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28(7):98-101.