重組人集成干擾素α對(duì)金黃地鼠胚胎和胎鼠的毒性

柴振海，楊 東，蔡永明，申秀萍，劉昌孝

(天津藥物研究院天津市藥代動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193)

重組人集成干擾素 α(recombinant human consensus interferonα，rh-CINF)是深圳九先生物工程有限公司研制的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一種非天然存在的重組人Ⅰ型干擾素，由166個(gè)氨基酸組成，其生物活性遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)干擾素，臨床用于治療丙型肝炎［1－2］。在結(jié)構(gòu)上rh-CINF與Amgen公司的干擾素制劑Infergen(干復(fù)津)基本相同，都是通過對(duì)多種人源干擾素α亞型氨基酸順序的掃描分析，并通過在氨基酸順序的每一位置指定出現(xiàn)頻率最高的氨基酸而衍生出來的集成干擾素［3］。rh-CINF和Infergen的唯一區(qū)別僅為一個(gè)氨基酸的差異，即第158位氨基酸位點(diǎn)由亮氨酸改為纈氨酸［1］，這也是中國人干擾素與美國人干擾素唯一的一個(gè)氨基酸差異。因此，rh-CINF具有中國人自己的遺傳特性，更適合中國人使用，在我國開發(fā)該藥具有更好的臨床應(yīng)用前景。為了評(píng)價(jià)其安全性，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)ICH S5A對(duì)生殖毒性的技術(shù)要求和ICH S6對(duì)生物技術(shù)藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)的一般要求，選用rh-CINF的敏感動(dòng)物金黃地鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)rh-CINF的胚胎-胎鼠毒性進(jìn)行研究，以為臨床安全用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

rh-CINF，無色透明液體，含量 25 mg·L－1，批號(hào):20020602，由深圳九先生物工程有限公司提供。4～8℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用賦形劑配成25，7.5和1.25 mg·L－1，分 別 用 于 rh-CINF 100，30 和 5 μg·kg－1劑量組。賦形劑為無色透明液體，組成:PB 20 mmol·L－1，NaCl 0.1 mol·L－1，pH 6.8 ～ 7.2，批號(hào):20020301，由深圳九先生物工程有限公司提供。4～8℃冰箱保存。T2000型電子天平，美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司常熟雙杰測(cè)試儀器廠;PL203電子天平，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;游標(biāo)卡尺，陜西航空硬質(zhì)合金工具廠;實(shí)體顯微鏡，日本Olympus株式會(huì)社。

1.2 動(dòng)物

妊娠第0天金黃地鼠，80只，體重92～146 g，由北京生物制品研究所動(dòng)物室提供，動(dòng)物合格證號(hào):0025104，動(dòng)物許可證號(hào):京動(dòng)許字(1999)第012號(hào)。飼養(yǎng)設(shè)施為天津藥物研究院屏障系統(tǒng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):津?qū)嵲O(shè)施準(zhǔn)字012號(hào))，觀察室溫度20～25℃，光照為12 h明、12 h暗;飼料為金黃地鼠專用飼料，并每日補(bǔ)充新鮮的大麥芽，飲用水為生活用自來水。

1.3 劑量設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)藥物組和1個(gè)賦形劑對(duì)照組。rh-CINF臨床擬用劑量為9～15μg(日用量)，按體表面積折算成金黃地鼠(按平均體重118 g計(jì))的等效劑量為1.02 ～1.70 μg·kg－1。本實(shí)驗(yàn)分別選用rh-CINF臨床擬用最高劑量的59，18和3倍即100，30 和5 μg·kg－1作為 rh-CINF 實(shí)驗(yàn)劑量。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

妊娠第0天金黃地鼠80只，隨機(jī)分成賦形劑對(duì)照組，rh-CINF 5，30和100 μg·kg－1組，每組20只。在妊娠第5～14天sc給予賦形劑或rh-CINF，每天1次，給藥體積為每100 g體重0.4 ml。

1.5 動(dòng)物一般情況觀察［4］

妊娠動(dòng)物在給藥前每日觀察1次一般情況。在給藥期間每日觀察藥后2 h內(nèi)的一般毒性反應(yīng)。若發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)，則增加觀察時(shí)間或觀察次數(shù)。一般觀察的內(nèi)容包括外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸和陰道出血等。在妊娠的第0天和第5～15天稱重。

1.6 解剖檢查

1.6.1 母鼠

母鼠在妊娠第15天進(jìn)行解剖檢查。檢查內(nèi)容包括腹腔、胸腔和顱腔有無積液，主要器官有無粘連，各器官的色澤、大小、形狀和表面是否正常。發(fā)現(xiàn)異常臟器時(shí)固定保存，并同時(shí)保存足夠的對(duì)照組相應(yīng)器官，供必要時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.6.2 胚胎

檢查羊水的顏色和量及胎盤的顏色和大小，然后檢查著床點(diǎn)數(shù)及活胎、死胎和吸收胎數(shù)量。

1.6.3 黃體計(jì)數(shù)

計(jì)數(shù)雙側(cè)卵巢上的黃體數(shù)。

1.6.4 胎鼠

胎鼠稱重并進(jìn)行外觀檢查和身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)測(cè)量。各窩活胎一半制成骨骼標(biāo)本，一半制成內(nèi)臟標(biāo)本，并進(jìn)行內(nèi)臟和骨骼畸形檢查。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 rh-CINF對(duì)母鼠一般情況的影響

rh-CINF 100，30 和 5 μg·kg－1組及賦形劑對(duì)照組母鼠在妊娠期間(包括給藥期間)被毛光澤，精神狀態(tài)、行為活動(dòng)和呼吸均正常，未發(fā)現(xiàn)分泌物增多、腹瀉、陰道出血和流產(chǎn)等現(xiàn)象，但 rh-CINF 100 μg·kg－1組孕鼠在給藥期間體重增長(zhǎng)顯著減緩(P ＜0.01)，rh-CINF 30 μg·kg－1組孕鼠在給藥期間體重增長(zhǎng)亦有減緩的趨勢(shì)(表1)。

2.2 rh-CINF對(duì)孕鼠生育能力的影響

在金黃地鼠受精卵著床至生產(chǎn)前sc給予rh-CINF，rh-CINF 100，30 和 5 μg·kg－1組孕鼠的黃體數(shù)、植入數(shù)、植入前丟失率及性別比例與賦形劑對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2，表3)。rh-CINF5 μg·kg－1組孕鼠吸收胎數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)及植入后丟失率與賦形劑對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;rh-CINF 30μg·kg－1組孕鼠活胎數(shù)減少、植入后丟失率增加，與賦形劑對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05);rh-CINF 100 μg·kg－1組孕鼠活胎數(shù)顯著減少，吸收胎數(shù)(窩)、死胎數(shù)及植入后丟失率顯著增加，與賦形劑對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.01)(表3)。表明rh-CINF具有一定的胚胎毒性。

表1 重組人集成干擾素α(rh-CINF)對(duì)妊娠金黃地鼠體重的影響Tab.1 Effects of recombinant human consensus interferonα(rh-CINF)on the body weight gain of golden Syrian hamsters

表2 rh-CINF對(duì)金黃地鼠黃體和植入的影響Tab.2 Effects of rh-CINF on the corpora lutea and implantation in golden Syrian hamsters

表3 rh-CINF對(duì)金黃地鼠胚胎的影響Tab.3 Effects of rh-CINF on the conceptus in golden Syrian hamsters

2.3 rh-CINF對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

rh-CINF 100 μg·kg－1組胎鼠身長(zhǎng)較短、平均胎鼠體重較輕，與賦形劑對(duì)照組比較有顯著差異(P ＜0.01);rh-CINF 30 和 5 μg·kg－1組胎鼠身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)以及平均胎鼠體重及rh-CINF 100μg·kg－1組胎鼠尾長(zhǎng)與賦形劑對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明rh-CINF 100 μg·kg－1對(duì)胎鼠的生長(zhǎng)發(fā)育有一定影響(表4)。

2.4 rh-CINF的致畸作用

2.4.1 rh-CINF 對(duì)胎鼠外觀的影響

在金黃地鼠妊娠第15天解剖后對(duì)胎鼠的外觀檢查中發(fā)現(xiàn)，各劑量組中均見個(gè)別胎鼠皮下出血，但給藥組皮下出血胎仔數(shù)及皮下出血窩數(shù)與賦形劑對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。除胎鼠皮下出血外，在rh-CINF 100，30 和5 μg·kg－1組和賦形劑對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)外觀畸形或變異胎鼠(表5)。

2.4.2 rh-CINF 對(duì)胎鼠骨骼的影響

表 6檢查結(jié)果顯示，rh-CINF 100，30和 5 μg·kg－1組顱骨、頸椎、胸椎、腰椎、骶椎和四肢骨均發(fā)育良好，上枕骨骨化程度均為0級(jí);檢查中發(fā)現(xiàn)的主要異常有胸骨發(fā)育不全、缺失和錯(cuò)節(jié)及14肋，但rh-CINF 100，30和5 μg·kg－1組中胸骨發(fā)育不全、胸骨缺失、胸骨錯(cuò)節(jié)及長(zhǎng)有14肋的胎仔數(shù)與賦形劑對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均不顯著。

表4 rh-CINF對(duì)金黃地鼠胎鼠發(fā)育的影響Tab.4 Effects of rh-CINF on the fetus development in golden Syrian hamsters

表5 rh-CINF對(duì)金黃地鼠胎鼠外觀的影響Tab.5 Effects of rh-CINF on the fetus externals in golden Syrian hamsters

表6 rh-CINF對(duì)金黃地鼠胎鼠骨骼發(fā)育的影響Tab.6 Effects of rh-CINF on the fetus skeleton system in golden Syrian hamsters

2.4.3 rh-CINF對(duì)胎鼠內(nèi)臟的影響

胎鼠的內(nèi)臟檢查采用徒手切片法，通過對(duì)不同切面的觀察，對(duì)胎鼠的眼、鼻、腭、舌、腦、氣管、食管、脊髓、胸腺、肺、縱隔、心、胃、腸、腎、腎上腺及生殖器官等進(jìn)行了系統(tǒng)的檢查。檢查結(jié)果顯示，rh-CINF 100，30和5μg·kg－1和賦形劑對(duì)照組中均未見任何內(nèi)臟異常、錯(cuò)位或畸形胎鼠。

3 討論

傳統(tǒng)的小分子藥物一般都沒有種屬特異性，在進(jìn)行生殖發(fā)育毒性評(píng)價(jià)時(shí)一般選用嚙齒類動(dòng)物大鼠和非嚙齒類動(dòng)物兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。有些生物技術(shù)藥物也不具有種屬特異性，可以和小分子藥物一樣，使用大鼠和兔作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行生殖發(fā)育毒性評(píng)價(jià)，但大多數(shù)生物技術(shù)藥物都具有種屬特異性，這時(shí)就必須根據(jù)具體藥物選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型應(yīng)該選擇能夠表達(dá)其生物學(xué)活性或能夠發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)的動(dòng)物種屬。rh-CINF作為生物技術(shù)藥物，具有明顯的種屬特異性，其安全性評(píng)價(jià)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的選擇亦應(yīng)遵循上述原則。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5］，利用多個(gè)種屬的動(dòng)物細(xì)胞系(大鼠、小鼠、豚鼠、兔、貓、狗和猴)進(jìn)行的體外抗病毒細(xì)胞病理效應(yīng)測(cè)定結(jié)果顯示，Infergen只在來自于恒河猴和金黃地鼠的細(xì)胞系中才具有病毒保護(hù)作用。Infergen的體內(nèi)抗病毒研究也都是用猴和金黃地鼠進(jìn)行的，且都顯示了明顯的抗病毒活性［5－6］。另外Infergen的生殖毒性研究也是使用恒河猴和金黃地鼠進(jìn)行的［5］。因Infergen與筆者研究的rh-CINF同屬于重組人集成干擾素α，具有幾乎相同的結(jié)構(gòu)和相同的生物學(xué)活性，因此rh-CINF生殖毒性研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型選用猴和金黃地鼠比較合適。

Ⅰ型干擾素在獼猴中具有高度免疫原性，妊娠獼猴在給予人源干擾素2周后即產(chǎn)生中和抗體［7］。由于獼猴的胚胎-胎鼠毒性實(shí)驗(yàn)的給藥時(shí)間均在30 d或更長(zhǎng)時(shí)間，這樣就不可避免地會(huì)在給藥后期出現(xiàn)降低藥物在母體的暴露水平和消除藥理學(xué)效應(yīng)的情況。因此，若使用猴進(jìn)行胚胎-胎鼠毒性實(shí)驗(yàn)，還必須調(diào)整給藥方案以分別測(cè)定妊娠敏感期不同階段給藥后藥物對(duì)胚胎-胎鼠的影響。由于金黃地鼠妊娠周期短，給藥期間不存在免疫原性問題，因此金黃地鼠是rh-CINF胚胎-胎鼠毒性實(shí)驗(yàn)的一種理想和經(jīng)濟(jì)的動(dòng)物模型。

使用妊娠金黃地鼠進(jìn)行的rh-CINF胚胎-胎鼠毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，妊娠金黃地鼠sc給予rh-CINF 100μg·kg－1可抑制孕鼠的體重增長(zhǎng)，并對(duì)孕鼠的胚胎有致死作用，對(duì)存活胎鼠的生長(zhǎng)發(fā)育包括胎仔身長(zhǎng)和體重也均有明顯影響;妊娠金黃地鼠sc給予rh-CINF 30 μg·kg－1可抑制孕鼠體重增長(zhǎng)，并對(duì)孕鼠胚胎有致死作用，但作用弱于高劑量組，且對(duì)存活胎鼠的生長(zhǎng)發(fā)育沒有影響。妊娠金黃地鼠sc給予rh-CINF 5 μg·kg－1對(duì)孕鼠生長(zhǎng)、胚胎存活及胎鼠發(fā)育均沒有影響。在對(duì)胎鼠的外觀、內(nèi)臟和骨骼檢查中均未見與藥物有關(guān)的胎鼠變異或畸形。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與FDA文件中描述的Infergen的生殖毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。5μg·kg－1可作為rh-CINF對(duì)孕鼠和胚胎-胎鼠的無可見不良反應(yīng)劑量。

干擾素類生物工程藥物一般都具有抗增殖作用［8］，這與本實(shí)驗(yàn)中rh-CINF引起金黃地鼠母體體重增長(zhǎng)緩慢是相一致的，但rh-CINF的致胚胎死亡作用和對(duì)胚胎生長(zhǎng)的影響是否與干擾素類藥物的抗增殖作用有關(guān)，以及rh-CINF對(duì)胚胎的影響是母體介導(dǎo)的毒性反應(yīng)，還是藥物穿過胎盤屏障直接作用于胚胎，這些問題都需要進(jìn)一步的研究。

胚胎致死作用和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩是生殖毒性的兩個(gè)重要指標(biāo)。雖然在受精卵著床至生產(chǎn)前妊娠金黃地鼠sc給予rh-CINF 5μg·kg－1(相當(dāng)于人用最大劑量的3倍)對(duì)金黃地鼠母體和胚胎均沒有明顯的影響，但更高劑量時(shí)已出現(xiàn)明顯的母體毒性、胚胎致死作用和胎鼠生長(zhǎng)遲緩。由于物種差異和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人類仍存在很多不確定性，因此，在沒有獲得足夠的臨床證據(jù)之前，rh-CINF和Infergen一樣，應(yīng)歸在妊娠用藥分級(jí)目錄中的C級(jí)，即妊娠或準(zhǔn)備懷孕的婦女在使用前應(yīng)被告知使用rh-CINF可能對(duì)胎兒造成的危害，并建議婦女在使用rh-CINF期間采取避孕措施。

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