異黃酮對高頻電磁場致雌性性腺毒性的保護(hù)作用

徐幽瓊，連 榮，汪家梨，陳 昱，陳國興，張文昌

(1.福建省福州市疾病預(yù)防控制中心，福建福州 350004;2.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建福州 350004)

高頻電磁場(high frequency electromagnetic field，HF-EMF)指頻率在100～300 MHz的電磁輻射，在鞋業(yè)的高頻膠合、塑料行業(yè)的塑料熱合、機(jī)械行業(yè)的淬火金屬熔煉、電子行業(yè)的顯像管制造過程中相當(dāng)常見［1］。前期研究顯示，女工暴露于30 MHz的 HF-EMF 100～400 V·m－1可引起月經(jīng)紊亂和性激素水平的改變［2］;雌性大鼠連續(xù)暴露HF-EMF 100～1600 V·m－156 d對性腺也有毒性作用，卵巢損害出現(xiàn)較早［3］。大豆異黃酮(isoflavones，IF)具有淬滅體內(nèi)異常增多的自由基與調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)等生物活性，國外許多學(xué)者將其用于抗各種頻率輻射治療［4－5］，效果較好，且 IF具有植物雌激素樣的作用，對卵巢有保護(hù)作用。但I(xiàn)F是否對制鞋業(yè)常見HF-EMF頻率(30 MHz)及作業(yè)現(xiàn)場常見的接觸劑量25～400 V·m－1的雌性性腺毒性具保護(hù)效應(yīng)，近20年未見文獻(xiàn)詳細(xì)報道。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

清潔級Wistar雌性大鼠60只，2月齡，體重160～180 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，批號:SCXK(瀘)2003-0003。IF，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號20040405，純度81.28%;卵泡刺激素(follicle-stimnlating hormone，F(xiàn)SH)、黃體酮生成素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)和孕酮(progestogen，P4)放免試劑盒由北京北方生物制品研究所提供;DeadEndTMFluorometric TUNEL System試劑盒，由美國Promega公司生產(chǎn)。

1.2 動物分組及給藥

60只大鼠按體重分層隨機(jī)分為5組，即IF對照組與 HF-EMF 25，100，400和1600 V·m－1組，每組12只。大鼠每日 ig給予 IF 150 mg·kg－1，除 IF對照組外，其余大鼠均置于輻射源上下兩極板中央?yún)^(qū)內(nèi)(電磁波平行于上下兩極板傳播)，頻率30 MHz，電場強(qiáng)度為 25，100，400 和 1600 V·m－1，其脈沖上升時間20 ns，持續(xù)時間3 s，間隔時間2 s。全身輻射8 h，每周連續(xù)照射5 d，停2 d，共8周。

1.3 黃體生成素，卵泡刺激素，雌二醇和孕酮的測定

制備血清，采用放免法(RIA)，將被測培養(yǎng)液和125I標(biāo)記的E2(P4，F(xiàn)SH和LH)衍生物與定量的兔抗加在一起，混勻后37℃孵育1 h(FSH和LH為20 h)，待反應(yīng)平衡后，加入分離劑，離心(1710 g×15 min)，吸去上清游離部分，應(yīng)用智能放免γ測量儀測定各管沉淀部分的放射性計數(shù)(cpm)。

1.4 大鼠動情周期判斷標(biāo)準(zhǔn)

輻射第48～56天，每天早7:00，晚7:00應(yīng)用陰道細(xì)胞涂片法［20］觀察大鼠動情周期的變化情況，低倍鏡觀察陰道脫落細(xì)胞的變化，判斷動情周期。

1.5 卵巢臟器系數(shù)的計算及各級卵泡數(shù)目測定

輻射第56天后，待大鼠進(jìn)入動情期(陰道細(xì)胞涂片法判斷)處死，立即取大鼠血與卵巢。卵巢稱重，并計算卵巢臟器系數(shù)=〔臟器質(zhì)量(g)/體重(g)×100〕。卵巢標(biāo)本置于10%中性甲醛緩沖液固定、沖洗、脫水與包埋，每個卵巢5μm連續(xù)切片105張，每隔20張取1張切片，用HE染色法計算卵巢中各等級卵泡的數(shù)目構(gòu)成比。每個卵巢標(biāo)本取5張切片，每組隨機(jī)選6個標(biāo)本。

1.6 電鏡觀察卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變

每組隨機(jī)選2個標(biāo)本，在大鼠未處死前迅速取其卵巢，冰上用鋒利的刀片取大小1 mm3左右的卵巢組織，立即放入固定液。3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定，乙醇-丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋;超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察、攝影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 異黃酮對高頻電磁場雌性性腺毒性大鼠動情周期的影響

如表1所示，與IF對照組比較，HF-EMF 1600 V·m－1組動情間期時間明顯延長(P ＜0.01)，動情前期、動情期和動情后期時間各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 異黃酮對高頻電磁場雌性性腺毒性大鼠血清激素水平的影響

如表2所示，IF給藥后，隨輻射劑量的增大，各組血清LH和FSH水平呈上升趨勢，E2和P4水平呈下降趨勢，與 IF對照組比較，HF-EMF 1600 V·m－1組的 LH 水平顯著增高(P ＜0.01);FSH，E2與P4水平各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 異黃酮對高頻電磁場雌性性腺毒性大鼠卵巢濕重及臟器系數(shù)的影響

如表3所示，HF-EMF 25～1600 V·m－1與 IF對照組比較大鼠卵巢濕重及卵巢臟器系數(shù)無明顯差異。

2.4 異黃酮對高頻電磁場雌性性腺毒性大鼠各級卵泡數(shù)目構(gòu)成比的影響

如表4所示，與IF對照組比較，HF-EMF 1600 V·m－1各組黃體數(shù)目構(gòu)成比、HF-EMF 400和1600 V·m－1組閉鎖卵泡構(gòu)成比明顯升高(P ＜0.01)，HF-EMF 1600 V·m－1組初/次級卵泡構(gòu)成比、成熟卵泡構(gòu)成比顯著降低(P＜0.01);原始卵泡構(gòu)成比無明顯差異。

2.5 異黃酮對高頻電場磁雌性性腺毒性大鼠卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖1顯示，與 IF對照組比較，HF-EMF 1600 V·m－1組異染色質(zhì)增多，成塊狀，染色質(zhì)邊集，線粒體出現(xiàn)水腫，基質(zhì)變稀，電子密度明顯下降，甚至空泡狀，線粒體嵴變短而少，甚至發(fā)生斷裂;HF-EMF 400 V·m－1組有小部分細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)成塊、邊集，線粒體也出現(xiàn)少量異常;HF-EMF 100 V·m－1組細(xì)胞核膜大部分是完整的，核仁也較清楚，但少部分細(xì)胞核染色質(zhì)成塊，核仁邊集，甚至出現(xiàn)核固縮，線粒體嵴變短而少，HF-EMF 25 V·m－1組常染色質(zhì)多見、異染色質(zhì)少見;在細(xì)胞質(zhì)中可見豐富的線粒體，多呈橢圓形和菱形，結(jié)構(gòu)大部分較完整，板狀嵴較清楚完整。

表1 異黃酮(IF)對高頻電磁場(HF-EMF)所致大鼠動情周期影響Tab.1 Effect of isoflavones(IF)on estrus cycles in rats during the high frequency electromagnetic field(HF-EMF)exposure

表2 IF對暴露于HF-EMF的大鼠激素水平的影響Tab.2 Effect of IF on serum hormones levels in rats exposed to HF-EMF

表3 IF對暴露于HF-EMF的大鼠卵巢濕重及臟器系數(shù)影響Tab.3 Effect of IF on organ wet weight and organ coefficient in rats exposed to HF-EMF

表4 IF對HF-EMF致大鼠各級卵泡數(shù)目構(gòu)成比影響Tab.4 Effect of IF on the constituent ratio of the different follicles in rats ovaries

圖1 IF對暴露于HF-EMF的雌性大鼠卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響〔醋酸鈾-檸檬酸鉛染色 ×2500(A)，×3600(B)，×7000(C)，×9000(D 和E)〕.A－E:分別為HF-EMF 0(IF對照)，25，100，400和1600 V·m－1組.Fig.1 Effect of IF on ultramicrostructure of cells of the ovaries inferior chronicity in rats exposed to HF-EMF〔Uranium acetate-lead citrate staining ×2500(A)，×3600(B)，×7000(C)，×9000(D and E)〕.

3 討論

目前職業(yè)性有害因素對女(雌)性生殖系統(tǒng)的影響已引起廣泛重視［6－7］，尤其是電磁輻射對生殖系統(tǒng)影響已成為全球性公共衛(wèi)生熱點問題［8－9］。IF是一類天然植物雌激素，主要包括染料木素、大豆黃素及少量的黃豆素。IF的結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌二醇相似，主要與雌激素受體β相結(jié)合，可發(fā)揮雌激素和抗雌激素作用［10－11］。一般認(rèn)為，IF在低濃度時發(fā)揮雌激素作用，而在高濃度時有抗雌激素作用［12－13］。該實驗采用文獻(xiàn)報道認(rèn)為有抗輻射作用的IF 150 mg·kg－1作為實驗劑量［14］。

動情周期觀察結(jié)果顯示，與IF對照組比較，只有HF-EMF 1600 V·m－1組大鼠動情間期時間顯著延長;與筆者前期實驗結(jié)果相比［3］，HF-EMF 100 V·m－1與400 V·m－1組動情前期明顯延長，HF-EMF 400 V·m－1組動情前期時間明顯縮短，結(jié)果表明，ig給予IF后，動情前期時間(即卵泡發(fā)育時間)已轉(zhuǎn)為正常，雖然動情間期時間有延長，但整個動情周期時間延長不明顯。提示IF對動情前期和動情間期有影響，尤其是對HF-EMF 100和400 V·m－1組影響較大。

基礎(chǔ)研究顯示［15］，雌性動情周期正常與否有賴于下丘腦-垂體-卵巢軸正常的調(diào)節(jié)，在這一性腺軸中，F(xiàn)SH，LH，E2和P4激素是維持正常動情周期最主要的激素。從前期研究結(jié)果［3］可知，HF-EMF對大鼠性激素水平的影響主要是促進(jìn)垂體合成與分泌LH，抑制卵巢合成分泌E2和P4;ig給予大鼠IF后，各組大鼠E2水平上升，LH水平下降。其中HF-EMF 100～400 V·m－1組E2水平顯著上升，LH水平顯著下降。其原因可能是IF的結(jié)構(gòu)與E2相似，在體內(nèi)低E2水平情況下，發(fā)揮E2作用，解除輻射后體內(nèi)E2水平降低，使負(fù)反饋(E2和P4水平下降導(dǎo)致負(fù)反饋到下丘腦和垂體，促進(jìn)垂體更多地合成與分泌LH)減弱，致使IF處理的大鼠血清LH水平比未用IF處理的大鼠低。

從前期研究結(jié)果［3］提示，HF-EMF對大鼠生殖內(nèi)分泌功能損傷的早期表現(xiàn)在卵巢，本文大鼠用IF處理后，HF-EMF 100 V·m－1組初/次級卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)構(gòu)成比有上升趨勢，而閉鎖卵泡與黃體數(shù)目構(gòu)成比有下降趨勢;HF-EMF 400 V·m－1組初/次級卵泡數(shù)構(gòu)成比有上升趨勢，但閉鎖卵泡構(gòu)成比也呈顯著增加，成熟卵泡數(shù)構(gòu)成比則無顯著上升;HFEMF 1600 V·m－1組大鼠初/次級卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)構(gòu)成比顯著減少，閉鎖卵泡與黃體數(shù)目構(gòu)成比顯著增加。由此可見，IF有促進(jìn)卵泡發(fā)育作用，但對高輻射劑量組效果不明顯，尤其是HF-EMF 1600 V·m－1組?；A(chǔ)研究顯示，E2可促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，LH主要促使卵泡形成黃體，因此IF進(jìn)入鼠體內(nèi)，使E2水平上升，促進(jìn)卵泡發(fā)育，并同時使LH水平下降，抑制卵泡形成黃體。

透射電鏡觀察卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，ig給予IF后，HF-EMF 100～400 V·m－1組大鼠卵巢細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮明顯減少，線粒體出現(xiàn)水腫數(shù)目下降，尤其是 HF-EMF 100 V·m－1，但 HF-EMF 1600 V·m－1組的細(xì)胞核里染色質(zhì)邊集較多見，有的甚至出現(xiàn)核崩解，線粒體出現(xiàn)腫脹、水腫數(shù)目明顯增多，有的甚至出現(xiàn)空泡狀，這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變必將引起卵巢分泌功能的損傷，使卵泡發(fā)育與閉鎖出現(xiàn)異常，相應(yīng)動情周期也出現(xiàn)變化，這與本次研究結(jié)果相一致。

總而言之，在本實驗條件下觀察到IF對亞慢性暴露于HF-EMF 25～400 V·m－1雌性性腺毒性有較好的保護(hù)效應(yīng)作用，具體表現(xiàn)為IF可提高血清中E2水平，促進(jìn)卵泡發(fā)育，抑制卵泡閉鎖與黃體形成，使動情周期維持穩(wěn)定而達(dá)到對HF-EMF性腺毒性保護(hù)效應(yīng)。未觀察到IF對高劑量(1600 V·m－1)亞慢性暴露HF-EMF雌性性腺毒性有較好的保護(hù)效應(yīng)。

［1］金泰廙.職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學(xué)［M］.第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:191-192.

［2］徐幽瓊，李寶華，程懷民，張文昌，洪惠民，林應(yīng)燊，等.職業(yè)接觸高頻電磁場對女工生殖內(nèi)分泌的影響［J］.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2008，26(6):332-335.

［3］徐幽瓊，鄭能雄，李寶華，張文昌，林新國，汪家梨，等.亞慢性暴露高頻電磁場對雌性大鼠性腺的毒性作用［J］.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2009，27(9):29-32.

［4］Wei H，Cai Q，Rahn RO.Inhibition of UV light-and Fenton reaction-induced oxidative DNA damage by the soybean isoflavone genistein［J］.Carcinogenesis，1996，17(1):73-77.

［5］Wang Y， Zhang X， Lebwohl M，DeLeo V，Wei H.Inhibition of ultraviolet B(UVB)-induced c-fos and c-jun expression in vivo by a tyrosine kinase inhibitorgenistein［J］.Carcinogenesis，1998，19(4):649-654.

［6］Zhang W，Jia H.Effect and mechanism of cadmium on the progesterone synthesis of ovaries［J］.Toxicology，2007，239(3):204-212.

［7］Zhang W，Pang F，Huang Y，Yan P，Lin W.Cadmium exerts toxic effects on ovarian steroid hormone release in rats［J］.Toxicol Lett，2008，182(1-3):18-23.

［8］Shaw GM.Adverse human reproductive outcomes and electromagnetic fields:a brief summary of the epidemiologic literature［J］.Bioelectromagnetics，2001，(S5):5-18.

［9］Heynick LN，Merritt JH.Radiofrequency fields and teratogenesis［J］.Bioelectromagnetics，2003，(S6):174-186.

［10］Kurzer MS， Xu X. Dietary phytoestrogens［J］.Annu Rev Nutr，1997，17:353-381.

［11］Tang BY，Adams NR.Effect of equol on oestrogen receptors and on synthesis of DNA and protein in the immature rat uterus［J］.J Endocrinol，1980，85(2):291-297.

［12］Hsu JT， Jean TC， Chan MA， Ying C.Differential display screening for specific gene expression induced by dietary nonsteroidal estrogen［J］.Mol Reprod Dev，1999，52(2):141-148.

［13］Wang C，Kurzer MS.Phytoestrogen concentration determines effects on DNA synthesis in human breast cancer cells［J］.Nutr Cancer，1997，28(3):236-247.

［14］吳明玉，朱國英，高林峰，項希橋.大豆異黃酮對腎輻射損傷大鼠骨量和骨結(jié)構(gòu)的影響［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2006，12(2):152-156.

［15］Tandon OP，Chintala R.Hypothalamo-pituitary-gonadal axis in control of female reproductive cycle［J］.Indian J Physiol Pharmacol，2001，45(4):395-407.