海藻和海藻酸鈉中糖醛酸含量的測定

張文婧，李靜梅，吳 穎，梁 平，石 波，*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京100081；3.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，北京100026）

海藻和海藻酸鈉中糖醛酸含量的測定

張文婧1，李靜梅2，吳 穎3，梁 平1，石 波1，*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京100081；3.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，北京100026）

利用陰離子交換樹脂對酸水解后的海藻酸鈉進行分離，得到D-甘露糖醛酸（M）和L-古洛糖醛酸（G），經(jīng)過高效液相色譜、電噴質(zhì)譜及核磁共振確定其純度和結(jié)構(gòu)。利用自制的M和G作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用外標(biāo)法計算得到海藻酸鈉樣品中M含量為63.06%，G含量為11.48%；海藻樣品中M含量為21.65%，G含量為4.67%。該實驗為海藻膠及海藻寡糖中的D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸含量的測定奠定了一定的基礎(chǔ)。

D-甘露糖醛酸，L-古洛糖醛酸，高效液相色譜，檢測

海藻中的海藻酸是由D-甘露糖醛酸（D-Mannuronic Acid，簡稱 M）和 L-古洛糖醛酸（L-Guluronic Acid，簡稱G）組成的一種酸性多糖。其因主鏈上連接的M和G位置的不同而決定了其結(jié)構(gòu)的不同，理化性質(zhì)隨著M/G比例而改變，相應(yīng)的M/G比例也決定了在食品、醫(yī)藥和紡織等方面的不同用途。Patrick等曾對已攝入Sr-85的動物飼喂M/G具有不同比值的海藻酸鈉進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)海藻酸鈉中G的含量增高時能有效地抑制Sr-85在動物體內(nèi)的吸收［1］。目前在工業(yè)上使用的是海藻酸的鈉鹽即海藻酸鈉。因此，快速、準(zhǔn)確地測定出海藻和海藻酸鈉中M和G的含量具有極其重要的價值，其結(jié)構(gòu)見圖1。由于高純度的M和G單一組分規(guī)?；苽渚哂幸欢ǖ碾y度，因此目前通常采用核磁共振（NMR）的方法測定海藻和海藻酸鈉中M和G的含量［2-3］，該方法需要核磁共振儀器和專業(yè)儀器操作人員，這極大地制約了對于褐藻和海藻酸以及鈉鹽的研究和應(yīng)用。本研究首先以海藻酸鈉為原料，制備出高純度的D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸單一組分，然后選擇高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC）的方法，將所得到的M和G作為標(biāo)準(zhǔn)品，測定海藻和海藻酸鈉中兩種糖醛酸M和G的比值和含量，以實現(xiàn)海藻及海藻酸鈉中M和G含量的快速、準(zhǔn)確測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海藻 山東蓉城2007年產(chǎn)，粉碎機粉碎；海藻酸鈉、無水碳酸鈣、氫氧化鈉 國藥集團化學(xué)試劑公司，分析純；硫酸、鹽酸、冰醋酸 北京化工廠，分析純；1×8陰離子交換樹脂 美國Dowex，200目；重蒸水，蒸餾水。

圖1 D-甘露糖醛酸結(jié)構(gòu)和L-古洛糖醛酸結(jié)構(gòu)

Waters 2695高效液相色譜儀 附配有 Waters 2414示差檢測器，美國Waters公司；AR 2140分析天平 感量：0.0001g，美國奧豪斯公司；FD-1D真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；RVC 2-18旋轉(zhuǎn)真空離心濃縮儀 德國Christ；BSZ-30自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；IKA加熱磁力攪拌器德國IKA；APEXII型FT-ICR質(zhì)譜儀 美國Bruker Daltonic；Bruker ARX-400核磁共振儀 瑞士Bruker；常壓玻璃層析柱 Φ45×450mm，中國科學(xué)院過程研究所；Silica Gel F254硅膠板 MERCK；烘箱 350± 1℃，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FW100高速萬能粉碎機 24000r/min，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SAX 4.6× 250mm 5-Micron Agilent；柱溫：40℃；流動相：0.7mol/L乙酸；流速：1.0mL/min；測定波長：示差檢測；示差檢測器溫度：40℃；進樣量：10μL［4］。

1.2.2 D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸的制備 稱取海藻酸鈉5g，加入76%的硫酸50mL，常溫下攪拌反應(yīng)2.5h，再加入650mL蒸餾水，沸水浴中水解3h，冷卻后加稍過量的無水CaCO3中和，抽濾，并用蒸餾水洗滌濾渣兩次，合并濾液，40℃下真空濃縮至體積為5mL，用0.1mol/L NaOH調(diào)pH為8.0，并保持0.5h不變。

取上述海藻酸鈉水解液上已轉(zhuǎn)為CH3COO-型的Dowex1×8陰離子交換樹脂柱，用0.5～2mol/L的乙酸溶液以2mL/min的速度進行梯度洗脫，用自動部分收集器收集，每瓶收集150mL，共收集60瓶。

在每個收集瓶中取20μL液體，按順序點于硅膠板上，晾干后噴5%硫酸乙醇顯色劑，并于110℃烘箱中烘5min。

按照薄層層析檢測結(jié)果，將相同組分的收集液合并，45℃真空濃縮后冷凍干燥，用HPLC分析其純度。并對其進行ESI-MS和1H NMR以及13C NMR測定，確定兩組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取制得G標(biāo)準(zhǔn)品，用重蒸水溶解，配制成濃度為 1.07、2.14、3.21、5.35、10.7mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取制得的M標(biāo)準(zhǔn)品，用重蒸水溶解，配制成濃度為1.2、6.0、12、24、30mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進樣10μL進行HPLC測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和進行線性回歸。

1.2.4 樣品處理及檢測 準(zhǔn)確稱取300mg（精確至± 0.0001g）海藻酸鈉，加入72%硫酸溶液3.5mL，于研缽中研磨2h，用100mL蒸餾水將其轉(zhuǎn)移至250mL三角瓶中，100℃沸水浴加熱2.5h，于自來水中冷卻至室溫，加入過量BaCO3粉末，充分反應(yīng)至溶液pH為7左右，3000r/min離心，沉淀用150mL蒸餾水洗滌3次，將上清液和洗滌液合并在一起，45℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮后，定容至10mL，進樣10μL進行HPLC測定。海藻樣品的處理方法同上，濃縮后定容至5mL，進樣10μL進行HPLC測定。依據(jù)樣品測定的峰面積和出峰時間，在相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所測組分的量，結(jié)合所取樣品的質(zhì)量和定容體積，計算出各組分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸單一組分的分離純化

硫酸水解海藻酸鈉所得產(chǎn)物見圖2。由圖2可知，海藻酸鈉酸水解產(chǎn)物含有2個主要組分A和B，保留時間分別為6.993min和7.934min。

圖2 海藻酸鈉酸水解產(chǎn)物的HPLC譜圖

將海藻酸鈉酸水解產(chǎn)物經(jīng)Dowex1×8陰離子交換樹脂層析柱分離，所得每個收集瓶中收集液薄層層析顯色，結(jié)果（圖3）表明，含有糖的洗脫液均有斑點顯示，并可以看出共有3組斑點，其中第一組為中性糖［5］，第二組為組分A，第三組為組分B。

圖3 陰離子交換樹脂層析柱分離所得收集液的TLC結(jié)果

圖4和圖5分別為冷凍干燥得到的組分A和組分B的HPLC檢測譜圖。組分A的保留時間為7.008min，組分B的保留時間為10.557min。

圖4 組分A的HPLC譜圖

通過與圖2中保留時間的比較得知，組分A和B這兩種物質(zhì)在Dowex1×8陰離子交換樹脂為分離介質(zhì)、乙酸水溶液為洗脫液的層析柱中得到了有效地分離，且HPLC的分析純度（以峰面積百分比計）均達到99%以上。

圖5 組分B的HPLC譜圖

2.2 L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定

將柱層析分離后所得的組分峰A和B分別收集，冷凍干燥后進行MS和1H NMR以及13C NMR檢測，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

組分峰A：1H-NMR（400MHz，D2O）：α體，δ= 4.96（1H，d，J=8.4Hz，H-1），3.99（1H，d，J=3.6Hz，H-2），4.01（1H，d，J=3.6Hz，H-3），4.10（1H，s，H-4），4.58（1H，s，H-5）；β體，δ=5.30（1H，d，J= 3.6HzH-1），3.70（1H，dd，J=8.4Hz，H-2），4.17（1H，d，J=4Hz，H-3），4.15（1H，d，J=3.6Hz，H-4），4.27（1H，s，H-5）。13C-NMR，（100MHz，D2O）：α體，δ=92.98（C-1），66.91（C-2），70.89（C-3），70.65（C-4），73.56（C-5），175.06（C-6）；β體，δ=93.65（C-1），68.60（C-2），71.10（C-3），70.76（C-4），73.56（C-5），174.08（C-6）。

ESIMS m/z 193［M］+（100），C6H10O7。根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)，確定組分峰A為L-古洛糖醛酸。

組分峰B：1H NMR，（400MHz，D2O）：α體，δ=5. 28（1H，d，J=2Hz，H-1），3.95（1H，d，J=4.4Hz，H-2），3.93（1H，d，J=1.6Hz，H-3），3.82（1H，s，H-4），4.26（1H，dd，J=5.4Hz，H-5）；β體，δ=4.98（1H，s，H-1），3.99（1H，d，J=3.2Hz，H-2），3.80（1H，s，H-3），3.73（1H，d，J=2Hz，H-4），3.67（1H，s，H-5）。13C-NMR，（100MHz，D2O）：α體，δ=93.85（C-1），68.28（C-2），70.27（C-3），70.07（C-4），72.42（C-5），175.05（C-6）；β體，δ=93.99（C-1），68.73（C-2），71.02（C-3），69.61（C-4），72.81（C-5），174.56（C-6）。

ESIMS m/z 193［M］+（100），C6H10O7。根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)，確定組分峰B為D-甘露糖醛酸。

2.3 海藻酸鈉中L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸含量的測定結(jié)果

根據(jù)圖6，以L-古洛糖醛酸峰面積（Y）對應(yīng)質(zhì)量濃度（X，mg/mL）作回歸分析，得到回歸方程為y= 40396x-20326，R2=0.997。

根據(jù)圖7，以D-甘露糖醛酸峰面積（Y）對應(yīng)質(zhì)量濃度（X，mg/mL）作回歸分析，得到回歸方程為：y=24689x-3244，R2=0.999。

由圖6和圖7的結(jié)果可以得出，在1.07～10.7mg/mL范圍內(nèi)，L-古洛糖醛酸具有良好的線性關(guān)系；在1.2～30mg/mL范圍內(nèi)，D-甘露糖醛酸具有良好的線性關(guān)系。

圖6 L-古洛糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 D-甘露糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖8 海藻酸鈉完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖

圖8為海藻酸鈉完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖。按照外標(biāo)法計算樣品中D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸的含量分別為63.06%和11.48%，M/G=5.493。用HPLC檢測獲得的峰面積比值代表樣品中M和G的含量比，海藻酸鈉中的M/G=3.20，誤差較大。選擇D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線才能準(zhǔn)確地測定出海藻酸鈉樣品中兩種糖醛酸的含量。

2.4 海藻中G和M含量測定結(jié)果

圖9為海藻中褐藻完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖，按照外標(biāo)法計算褐藻樣品中D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸的含量分別為21.65%和4.67%，M/G= 4.636。而用HPLC檢測獲得的峰面積比值代表樣品中M和G的含量比，則褐藻中的M/G=2.819，與實際比值存在較大的誤差。

圖9 褐藻完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖

3 結(jié)論

選擇Dowex1×8強堿型陰離子交換樹脂為制備型常壓柱層析的分離介質(zhì)，乙酸水溶液為洗脫液，進行梯度洗脫，可以成功地從海藻酸鈉硫酸水解液中分離純化出L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸，兩組分純度分別達到99%以上。一次性上樣由5g海藻酸鈉制得的硫酸水解液，可獲得的L-古洛糖醛酸純品0.5839g，D-甘露糖醛酸純品1.7614g。采用本實驗制備的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC檢測，海藻酸鈉和褐藻中的L-古洛糖醛酸及D-甘露糖醛酸的含量分別為11.48%和63.06%以及4.67%和21.65%。本實驗為測定褐藻和海藻酸鈉中L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸的含量提供了一個方便、準(zhǔn)確的方法。

［1］Patrick G，Carr T E F，Humphreys E R.Inhibition by Alginates of Strontium Absorption Studied in Vivo and in Vitro［J］.International Journal of Radiation Biology，1967，12：427-434.

［2］Keiichiro M，Hironori M，Hajime K，et al.Decomposition Reaction of Alginic Acid Using Subcritical and Supercritical Water［J］.Eng Chem Res，2005，44（25）：9626-9630.

［3］Riki Shiroma，Shuntoku Uechi，Shinkichi Tawata.Isolation and Characterization of Alginate from Hizikia fusiformis and Preparation of its Oligosaccharides［J］.Journal of Applied Glycoscience，2007，54（2）：85-90.

［4］Voragen A G J，Schols H A，Devries J A，et al.Highperformance liquid chromatography analysis of uronic acid and oligogalacturonic acids［J］.Journal of Chromatography，1982，244，327-336.

［5］Haug A，Larsen B.Quantitative Determination of the Uronic Acid Composition of Alginates［J］.Acta Chemica Scandinavica，1962，16，1908-1918.

Quantitative determination of uronic acid in seaweeds and sodium alginate

ZHANG Wen-jing1，LI Jing-mei2，WU Ying3，LIANG Ping1，SHI Bo1，*
（1.Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2.Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；3.Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute，Beijing 100026，China）

The column chromatography with anion-exchange resin was used for isolating mannuronic acid（M）and guluronic acid（G）from hydrolyzed alginate sodium，the collected components were analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC），ESl-MS and NMR.M and G was used as a standard，external reference method was used for assay of M and G in brown algae and alginate sodium.The concentration of M in brown algae was 21.65%and G was 4.67%，also alginate sodium has 63.06%M and 11.48%G.The experiment built a new method for quantitating D-mannuronic acid and L-guluronic acid in sodium alginate and seaweed oligosaccharides.

D-mannuronic acid；L-guluronic acid；high performance liquid chromatography；detection

TS254.1

A

1002-0306（2010）12-0338-04

2010-04-08 *通訊聯(lián)系人

張文婧（1984-），女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物與糖工程在飼料添加劑方面的研究。

“十一五”國家海洋“863”課題（2007AA091601-2）。