松香基功能高分子稀土離子配合物固定化糖化酶

袁 霖,盧建芳,雷福厚,,段文貴

（1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧530006;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院,廣西南寧 530006）

松香基功能高分子稀土離子配合物固定化糖化酶

袁 霖1,盧建芳2,雷福厚1,2,段文貴1

（1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧530006;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院,廣西南寧 530006）

分別以聚馬來(lái)松香己二醇酯（PM HE）、馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯聚合物（PMAGE）和馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯-丙烯酸共聚物[Poly（MAGE2AA）]為載體,以 Y3+為橋鍵配離子固定化糖化酶,并測(cè)定了固定化糖化酶的性能。結(jié)果表明,Poly（MAGE2AA）Y En固定化酶的性能較好,最適溫度為50℃,比游離酶高出10℃;最適p H值為5.01;重復(fù)使用5次后,活性為1888.00 U·g-1,說(shuō)明固定化糖化酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)。

松香基功能高分子;糖化酶;固定化酶;稀土離子

葡萄糖淀粉酶[Glucoam ylase,E（3.2.1.3）]又稱γ2淀粉酶,簡(jiǎn)稱糖化酶（縮寫(xiě) GA或 G）。糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶,主要用于水解淀粉、糊精、糖原等制備葡萄糖。葡萄糖是人體和動(dòng)物體新陳代謝中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也是運(yùn)動(dòng)所需能量的重要來(lái)源。同時(shí)葡萄糖在醫(yī)藥、食品、制革及印染等工業(yè)也有著廣泛的應(yīng)用[1,2]。用酶法代替高壓酸水解法生產(chǎn)葡萄糖是葡萄糖工業(yè)的重大突破,但由于游離酶存在著容易失活、不能回收、不易與產(chǎn)物分離、影響產(chǎn)品提純與質(zhì)量等缺陷,使得工業(yè)生產(chǎn)成本較高。酶經(jīng)固定化后,不僅抗性增強(qiáng)、可重復(fù)使用,且易與產(chǎn)物分離,因而固定化糖化酶在工業(yè)生產(chǎn)中受到廣泛關(guān)注[3～8]。

作者在此以天然可再生的松香為原料合成的聚馬來(lái)松香己二醇酯（PM HE）、馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯聚合物（PMAGE）和馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯-丙烯酸共聚物[Poly（MA GE2AA）]三種樹(shù)脂作載體,以稀土離子 Y3+為橋鍵配離子固定化糖化酶,并測(cè)定了其耐熱性、耐酸堿性、重復(fù)使用性。松香基功能高分子稀土離子配合物固定化酶模型見(jiàn)圖1。

圖1 松香基功能高分子稀土離子配合物固定化酶模型Fig.1 Model of immobilized enzyme on rosin based functional polymer2rare earth ion complexes

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

糖化酶,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;可溶性淀粉,北京試劑廠;葡萄糖、酚酞,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;36%乙酸、硫酸酮、四水合酒石酸鈉、硫代硫酸鈉,廣東汕頭市西隴化工廠;無(wú)水乙酸鈉,廣東臺(tái)山化工廠;碘化鉀、氫氧化鈉,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸,廉江市愛(ài)廉化試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

SYC215型超級(jí)恒溫水浴,南京桑力電子設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 松香基功能高分子的合成

1.2.1.1 PM HE樹(shù)脂

取30 g馬來(lái)松香和11.5 g己二醇（摩爾比1∶1.3）置于250 mL裝有分水器及回流冷凝管的三頸瓶中,加入1.2 g對(duì)甲苯磺酸、100 mL汽油與1,42二氧六環(huán)（體積比為5∶1）,加熱,130～140℃下攪拌反應(yīng)30 h。反應(yīng)結(jié)束后分離上層溶劑,用60～70℃的蒸餾水反復(fù)洗滌,干燥。產(chǎn)品再用環(huán)己烷回流6 h,干燥,得到聚馬來(lái)松香己二醇酯[9]。

PM HE樹(shù)脂的軟化點(diǎn)為 278℃,酸值為 21 m g KOH·g-1,交聯(lián)度為75%,平均孔徑為300。

1.2.1.2 PMAGE樹(shù)脂

（1）取30 g研細(xì)的馬來(lái)松香于裝有溫度計(jì)、分水器、攪拌器和回流冷凝管的250 m L三頸瓶中,加入80 m L汽油、2 g對(duì)甲苯磺酸、20 m L乙二醇、15 mL甲苯。加熱,在130℃反應(yīng)3 h。停止加熱,趁熱分離上層溶劑,用80℃的去離子水反復(fù)洗滌產(chǎn)物,放入烘箱干燥,得到馬來(lái)松香乙二醇酯。

（2）取40 g干燥的馬來(lái)松香乙二醇酯置于裝有溫度計(jì)、分水器、攪拌器和回流冷凝管的250 mL三頸燒瓶中,加入35 mL丙烯酸、2 g對(duì)甲苯磺酸、1.2 g對(duì)苯二酚、120 mL汽油。加熱,溫度從118℃緩慢升到140℃,直到?jīng)]有水分分出為止,趁熱分離上層溶劑,用80℃的去離子水反復(fù)洗滌產(chǎn)物,得到馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯。

（3）取15 g馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯置于裝有溫度計(jì)、分水器、攪拌器和回流冷凝管的250 mL三頸瓶中,加入100 m L汽油。加熱,溫度升到70℃時(shí)加入1.2 g偶氮二異丁腈,繼續(xù)升溫到85℃,反應(yīng)2 h。停止加熱,冷卻,抽濾,得聚馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯。

PMAGE樹(shù)脂的軟化點(diǎn)為320℃,酸值為54.3 mg KOH·g-1,交聯(lián)度為67%,平均孔徑為24。

1.2.1.3 Poly（MAGE2AA）樹(shù)脂

稱取30 g馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯、1.0 g偶氮二異丁腈、1.0 g丙烯酸放入溶劑中,超聲溶解,使之分散充分。反應(yīng)燒瓶中加入200 m L去離子水,升溫至60～70℃,將有機(jī)相倒入燒瓶中,在80～90℃攪拌反應(yīng)2 h,冷卻,抽濾,烘干,得馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯-丙烯酸共聚物[10]。

Poly（MAGE2AA）樹(shù)脂的軟化點(diǎn)為252℃,酸值為59.8 mg KOH·g-1,交聯(lián)度為60%,平均孔徑為250。

1.2.2 固定化糖化酶的制備

取 PM HE、PMAGE、Poly（MAGE2AA）三種樹(shù)脂在 Y3+溶液中回流7 h,立即取出冷卻,傾倒溶液,洗滌,得聚合物稀土離子配合物。取粒度均勻的配合物放置在酶溶液中浸泡,置于冰箱（約5℃）中48 h,過(guò)濾,洗滌,用濾紙吸干樹(shù)脂,5℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 固定化糖化酶活力的測(cè)定

酶活性測(cè)定參照D IAZYM E酶活測(cè)定法[11,12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化糖化酶的重復(fù)使用性

將各種固定化糖化酶同時(shí)置于恒溫槽中,在相同溫度下恒溫1 h,測(cè)定酶活,然后用蒸餾水洗滌,再測(cè)定酶活,重復(fù)5次,以某一單位時(shí)間內(nèi)生成的最大葡萄糖量活性表示為100,用第n次單位時(shí)間內(nèi)生成的葡萄糖量與最大葡萄糖量的比值表示固定化酶的相對(duì)活性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Y3+為配離子的固定化糖化酶的重復(fù)使用性Tab11 Repeated usability of immobilized glucoamylase using Y3+as bridging ion

由表1可知,沒(méi)有中間橋鍵離子的PM HE固定化酶重復(fù)使用第3次時(shí),已完全失活,且最大酶活性為871.40 U·g-1。而以 Y3+為橋鍵配離子的PM HE固定化酶重復(fù)使用5次后,酶活性仍達(dá)1271.40 U·g-1。這可能是因?yàn)槲垂潭ㄓ邢⊥岭x子的樹(shù)脂與糖化酶是以較弱的分子間力結(jié)合的,易被破壞。而固定有稀土離子的樹(shù)脂與糖化酶是以較強(qiáng)的配位鍵連接的,不易斷裂。因此,有稀土離子作為中間橋的樹(shù)脂固定化糖化酶效果較好。

2.2 溫度對(duì)游離糖化酶和固定化糖化酶的影響

分別將以 PM HE、PMAGE、Poly（MAGE2AA）為載體、以Y3+為橋鍵配離子的固定化糖化酶及游離糖化酶置于恒溫槽中,在不同溫度下恒溫1 h后測(cè)定酶的相對(duì)活性,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 溫度對(duì)游離糖化酶和固定化糖化酶相對(duì)活性的影響Tab12 Effect of temperature on relative activity of free glucoamylase and immobilized glucoamylase

由表2可知,三種固定化酶最適宜溫度均為50℃,比游離酶高出10℃。這可能是由于載體包裹著酶,減少了酶與底物的接觸,隨著溫度的升高,載體溶脹開(kāi),更多的酶能與底物充分接觸,酶的活性不斷增大,直至最大值;當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),酶會(huì)變性,反而使其活性降低。

2.3 p H值對(duì)游離糖化酶和固定化糖化酶的影響

選擇目數(shù)均勻的固定化糖化酶和游離糖化酶同時(shí)置于恒溫槽中,考察p H值對(duì)固定化糖化酶和游離糖化酶的相對(duì)活性的影響,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 pH值對(duì)游離糖化酶和固定化糖化酶相對(duì)活性的影響Tab13 Effect of pH value on relative activity of freeglucoamylase and immobilized glucoamylase

由表 3可知,Poly（M AGE2AA）YEn、PM AGEY En固定化糖化酶的最適p H值為5.01,與游離糖化酶最適宜p H值6.01比較,向酸性方向移動(dòng)了1個(gè)單位。這可能是因?yàn)椴煌潆x子使得固定化酶的耐酸堿性發(fā)生了移動(dòng);且底物、配體和氫離子濃度在樹(shù)脂配離子載體附近和本體溶液之間分布得不均勻,載體周?chē)木植繚舛群驼w溶液濃度不同,即酶的微環(huán)境發(fā)生變化,也導(dǎo)致最適宜p H值向低p H值移動(dòng)。

2.4 松香基功能高分子配位鍵法固定化糖化酶構(gòu)效關(guān)系

分別取一定量 PM HE、PMAGE、Poly（MAGE2 AA）3種樹(shù)脂與 Y3+配位生成配合物,用蒸餾水洗滌,洗滌后的樹(shù)脂高溫焙燒,再用濃 HCl/濃 HNO3混合酸將焙燒后的剩余氧化物消解,配成50 m L溶液,用ICP測(cè)定溶液中 Y3+的含量,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同樹(shù)脂的Y3+吸附量/mmol·g-1Tab14 The adsorption quantity of Y3+by different resin

由表4可知,PM HE、PMAGE和 Poly（MAGE2 AA）樹(shù)脂對(duì) Y3+的吸附能力大小依次為：Poly（M AGE2AA）>PMA GE>PM HE,這是由于松香基功能高分子的酸值、微孔面積和孔徑共同影響的結(jié)果。建立松香基功能高分子吸附金屬離子量與其孔徑、酸值及微孔面積的關(guān)系式為：

式中：m0表示松香基功能高分子吸附金屬離子物質(zhì)的量;k0表示吸附常數(shù);S表示微孔面積;j表示功能高分子的酸值;d表示功能高分子的孔徑。

PMAGE、Poly（MAGE2AA）、PM HE的微孔面積（m2·g-1）分別為 5.8056、3.3751、3.3547;酸值（mg KOH ·g-1）分別為 54.3、59.8、21;分子孔徑（A。）分別為 24、250、300;S·j·d1/3值分別為 909、1254、472。因此,Poly（MAGE2AA）樹(shù)脂吸附效果最佳,PMAGE樹(shù)脂次之,PM HE樹(shù)脂最差。

以 PMAGE、Poly（MAGE2AA）、PM HE 為載體、以Y3+為橋鍵配離子的固定化糖化酶的活性大小依次為：Poly（MAGE2AA）YEn>PM HEYEn>PMAGEYEn。這是樹(shù)脂的微孔面積和酸值共同作用的結(jié)果：樹(shù)脂的酸值越大,樹(shù)脂與金屬離子配位越多,載體連接上的酶越多;同時(shí)樹(shù)脂的微孔面積越大,與酶分子接觸的幾率越大,載體配位連接上的酶越多。建立固定化酶的活性與功能高分子載體微孔面積和酸值的關(guān)系式為：

式中：△U表示固定化酶的活性;k表示活性常數(shù);S表示微孔面積;j表示功能高分子的酸值;d表示功能高分子的孔徑。

PMAGE、Poly（MAGE2AA）、PMHE的S·j·d值分別為 7566、50 457、21 134。因此,以 Poly（MAGE2AA）為載體的固定化糖化酶活性最佳,PMHE為載體的次之,PMAGE為載體的最差。

對(duì)比式（1）和式（2）可知,功能高分子孔徑對(duì)樹(shù)脂吸附離子能力的影響要小于其對(duì)固定化酶活性的影響。這是因?yàn)?功能高分子吸附離子時(shí),離子較小,較易進(jìn)入樹(shù)脂孔徑內(nèi)部與內(nèi)部的-COOH結(jié)合,故孔徑對(duì)樹(shù)脂吸附離子量影響較小;而酶分子量很大,空間結(jié)構(gòu)大,與松香基功能高分子離子配合物發(fā)生配位生成固定化酶時(shí),酶分子很難進(jìn)入高分子內(nèi)部,僅在其表面發(fā)生反應(yīng),高分子孔徑越大,越利于酶分子進(jìn)入孔內(nèi)部,因此,高分子孔徑大小對(duì)酶分子在載體上的固定影響較大。據(jù)此,可以設(shè)計(jì)更理想的固定化酶功能高分子載體。

3 結(jié)論

采用天然可再生的松香為原料合成的樹(shù)脂為載體,以稀土離子 Y3+為橋鍵配離子固定化糖化酶,其中Poly（MAGE2AA）YEn固定化酶的性能較好,最適溫度為50℃,比游離酶高出10℃;最適p H值為5.01,重復(fù)使用5次后,活性為1888.00 U·g-1,說(shuō)明固定化糖化酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)。進(jìn)一步探索了松香基功能高分子配位鍵法固定化糖化酶構(gòu)效關(guān)系,為固定化酶載體的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。

[1] 張秀媛,袁永俊,何擴(kuò).糖化酶的研究概況[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2006,27（9）：1632166.

[2] Shkutina IV,Stoyanova O F,Selemenev V F.Specific features of glucoamylase immobilization by adsorption on fibrous polyelectro2 lytes[J].Russian Journal of Applied Chemistry,2005,78（6）：9812984.

[3] Lee Chan2won,Yi Song2se,Kim Juhan,et al.Imop roved immobi2 lized enzyme system s using sphericalmicro silica sol2gel enzyme beads[J].Biotechnology and Engineering,2006,11（4）：2772281.

[4] 王家東,姜子明,曹彬,等.固定化糖化酶的研究[J].中國(guó)調(diào)味品,2006,（3）：14216.

[5] 盛梅,楊文偉,郭登峰.固定化脂肪酶催化合成生物柴油[J].應(yīng)用化學(xué),2005,22（7）：7882791.

[6] 林建城,朱麗華,王志鵬,等.明膠固定化果膠酶的制備及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品科學(xué),2006,27（12）：3152318.

[7] Papagianni M,Joshi N,Moo2Young M.Comparative studies on extracellular p rotease secretion and glucoamylase p roduction by free and immobilizedAspergillus nigercultures[J].Journal of In2 dustrial Microbiology and Biotechnology,2002,29（5）：2592263.

[8] 喬德亮,胡冰,曾曉雄.酶固定化及其在食品工業(yè)中應(yīng)用新進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2008,29（1）：3042307.

[9] 雷福厚,盧建芳,姚興東,等.一種交聯(lián)功能基高聚物及其制備方法[P].CN 2007 10 051 901,2007210210.

[10] 雷福厚,盧建芳,李鵬飛,等.一種松香基功能高分子固定化淀粉酶及其制備方法[P].CN 2008 10 073 627.4,2008212210.

[11] 魏述眾.生物化學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社,1996：1252 261.

[12] 姜錫瑞.酶制劑應(yīng)用手冊(cè)（下冊(cè)）[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社,1999：2862289.

Immobilization of Glucoamylase by Rosin Based Functional Polymer2Rare Earth Ion Complexes

YUAN L in1,LU Jian2fang2,LEIFu2hou1,2,DUANWen2gui1
（1.College of Chem istry and Chem ical Industry,Guangxi University,N anning530006,China;2.College of Chem istry and Ecological Engineering,Guangx i University for N ationalities,N anning530006,China）

Immobilized glucoamylase were p repared by using polymer of maleated rosin acid2hexandiol ester（PM HE）,copolymer of maleated rosin acid2acrylic acid2glycol ester2acrylic acid[Poly（MAGE2AA）]and poly2 mer of maleated rosin acid2acrylic acid2glycol ester（PMAGE）as carriers and themethod of rare earth ion coor2 dination.The performances of the immobilized enzymes were determined.The result showed that the highest activity was observed for the Poly（MAGE2AA）YEn.The op timal temperature and p H value w as 50℃and 5.01,respectively.The immobilization enzyme activity was 1888.00 U·g-1after used for 5 cycles.It p roved that the stability of immobilized glucoam ylase w as increased.

rosin based functional polymer;glucoamylase;immobilized enzyme;rare earth ion

Q 814

A

1672-5425（2010）06-0062-04

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)基金資助項(xiàng)目（桂科攻08395003-9）

2010-03-18

袁霖（1984-）,男,湖南永州人,碩士研究生,研究方向：天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與應(yīng)用;通訊作者：雷福厚,教授。E2mail：leifuhou@163.com。