• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達

    2010-11-04 09:14:00周曉明莫雋穎付水林
    化學(xué)與生物工程 2010年6期
    關(guān)鍵詞:黑曲霉糖苷酶克隆

    周曉明,莫雋穎,陶 冶,付水林,宮 衡

    (華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237)

    黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達

    周曉明,莫雋穎,陶 冶,付水林,宮 衡

    (華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237)

    根據(jù) GenBank報道的黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因序列設(shè)計兩對特異性引物,分別以黑曲霉 H7總 RNA及基因組DNA為模板,擴增出β2葡萄糖苷酶基因bg l全長及活性中心所在的外顯子5序列E5,分別將其連接到pMD182T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α測序。結(jié)果表明,bg l序列全長2583 bp,與β2葡萄糖苷酶基因(XM 001398779.1)核苷酸序列同源性為99%,氨基酸序列同源性為99%,E5與bg l外顯子5區(qū)域同源性為100%。進一步構(gòu)建表達質(zhì)粒p ET32a(+)2bg l、p ET32a(+)2E5、p ET28a(+)2E5,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21(DE3)誘導(dǎo)表達,并進行 SDS2PAGE電泳分析。

    黑曲霉;β2葡萄糖苷酶;序列分析;蛋白表達

    β2葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)屬于糖苷水解酶家族3,是纖維素酶系的重要組成部分,但其含量最低,不足1%,且活性普遍偏低,是纖維素酶解轉(zhuǎn)化的瓶頸[1]。因此許多國內(nèi)外學(xué)者正致力于β2葡萄糖苷酶分子生物學(xué)方面的研究,以期改善纖維素酶的催化效率,實現(xiàn)纖維素資源的高效生物轉(zhuǎn)化。研究表明,黑曲霉是β2葡萄糖苷酶酶活較高的菌株[2,3],但關(guān)于黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因的研究報道仍然較少[4~7]。作者在此分別以黑曲霉(A.niger)H7總RNA及基因組DNA為模板,擴增β2葡萄糖苷酶基因bg l全長以及活性中心所在的外顯子5序列E5,并分別將兩段序列構(gòu)建到表達載體p ET32a(+)及p ET28a(+)上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達,為研究黑曲霉β2葡萄糖苷酶的重組表達奠定基礎(chǔ)。

    1 實驗

    1.1 菌株與質(zhì)粒

    A.nigerH 7,自行篩選;E.coliDH 5α、E.coliBL 21(DE3)、p ET32a(+)、p ET28a(+),自行保存 ;克隆載體pMD182T,大連寶生物公司。

    1.2 工具酶及主要試劑

    總RNA提取試劑、焦碳酸二乙酯(DEPC)、DNA MarkerⅢ、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒,北京天根公司;ExTaq DNA聚合酶、X2Gal、IPTG、PrimeScrip t RT Reagent試劑盒,大連寶生物公司;T4連接酶、BamH I、N otI限制性內(nèi)切酶,Fer2 mentas公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.3 培養(yǎng)基

    PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g·L-1(將馬鈴薯切成1 cm3方塊,置于1000 mL水中煮沸,過濾收集液體,即得),葡萄糖20 g·L-1,瓊脂粉 15 g·L-1。

    1.4 黑曲霉總 RNA及基因組DNA的抽提

    黑曲霉總RNA抽提采用 Trizol法,起始菌體量為500 mg,具體步驟參照說明書。抽提結(jié)束后用紫外分光光度計測定其OD230、OD260、OD280,并進行瓊脂糖凝膠電泳。

    黑曲霉基因組DNA抽提采用CTAB法,具體步驟參照文獻[8]。

    1.5 引物設(shè)計

    以 GenBank上已經(jīng)發(fā)表的黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因序列bgl 1(登錄號為AJ132386)為模板設(shè)計兩對特異性引物,擴增bg l全長的上游引物為 bgl2F:5′2 CGGGA TCC A TGAGGTTCACTTTGA TCGAGGC2 3′,下游引 物為 bgl2R:5′2A TTTGCGGCCGC AGT2 GAACA GTAGGCA GAGACGCC23′,采用的限制性酶切位點(劃線部分)分別為上游BamHI和下游NotI。擴增外顯子 5的上游引物為 E52F:5′2CGG2 GA TCCTCCGACTACAACTCTGCTTTCCCT23′,下游 引 物 為 E52R:5′2A TTTGCGGCCGCTGGCG2 GTCTTAGCAAGCGCCTCAA T23′。引物由上海生工公司合成。

    1.6 目的片段的擴增

    cDNA第一條鏈的合成:冰上取總 RNA 5μL、Oligo d T 0.5μL、Random Primer 1μL、RNase2free H2O 3.5μL于65℃保溫10 min,加入5×RT Buffer 4μL、RNase2free H2O 5μL、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μL,于42℃保溫1 h后85℃滅活5 min。將20μL體系用dd H2O稀釋至50μL,于-20℃保存。

    PCR擴增全長(50μL體系):10×ExTaq Buffer 5.0μL,dN TP 4.0μL,上游引物 1.0μL,下游引物1.0μL,cDNA第一條鏈 10.0μL,TaKaRaExTaq HS Enzyme 0.5μL,ddH2O 28.5μL補足。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 3 min,35個循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。E5片段擴增方法同上,采用基因組DNA為模板,退火溫度為59℃,延伸90 s。

    將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并對目的條帶進行膠回收。

    1.7 TA克隆

    將上述純化的PCR擴增產(chǎn)物與Ta KaRa pMD182 T載體連接,10μL連接體系如下:1μL pMD182T載體,4μL目的片段、5μL Solution I,16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,用含有 X2Gal、IPTG和100μg·m L-1Amp的LB平板篩選陽性克隆,對篩選到的轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒并進行PCR或雙酶切驗證。對鑒定正確的克隆進行測序,測序結(jié)果登陸NCB I網(wǎng)站進行BLAST比對分析。

    1.8 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

    將上述測序正確的質(zhì)粒用BamH I和N otI雙酶切后,與同樣雙酶切的表達載體連接,采用 T4 DNA連接酶,連接體系為:表達載體3.0μL,目的片段9.0 μL,5×Ligase Buffer 4.0μL,T4 DNA Ligase 1.0 μL,ddH2O 3.0μL補足至20.0μL。22℃連接6 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,并用含有100μg·m L-1Amp的LB平板進行篩選。對陽性轉(zhuǎn)化子進行雙酶切鑒定,將鑒定正確的陽性克隆分別命名為p ET32a(+)2bg l、p ET32a(+)2E5、p ET28a(+)2E5,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL 21(DE3)感受態(tài)細胞中。

    1.9 目的蛋白的誘導(dǎo)表達

    從新鮮的LB平板上挑取重組菌菌落,接種于25 m L帶有相應(yīng)抗性的 LB培養(yǎng)基中,37℃、200 r·min-1過夜培養(yǎng),以1%的比例接種到30 m L抗性LB培養(yǎng)基,37℃、200 r·m in-1培養(yǎng)至OD600約為0.4~0.5時,加入終濃度為1 mmol·L-1的 IPTG,30℃誘導(dǎo)表達約4 h。取1 m L菌液,12 000 r·min-1離心2 min,收集菌體,用 PBS緩沖溶液(p H值7.0)洗滌沉淀1~2次,并最終將其溶于500μL相同緩沖溶液中。超聲破碎細胞:功率200 W,每超聲2 s間隔4 s,共60次。4℃、12 000 r·min-1離心30 min,分別取上清與沉淀溶于相同的緩沖溶液中,以誘導(dǎo)前的重組菌株為對照進行SDS2PAGE電泳,分析重組蛋白表達情況。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 黑曲霉總 RNA及基因組DNA的提?。▓D1)

    圖1 黑曲霉總 RNA(a)和黑曲霉基因組DNA(b)Fig.1 Total RNA(a)and Genome DNA(b)of Aspergillus niger H7

    由圖1可以看出,抽提的黑曲霉總 RNA經(jīng)電泳后28 S和18 S條帶清晰,無拖尾,5 S部分降解較少,說明RNA完整性好,且28 S亮度比18 S略高,雖不能完全達到2∶1的比例,但仍可作為模板進行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄實驗。經(jīng)紫外分光光度計檢測,RNA樣品的OD260/OD280均值為 1.942、OD260/OD230均值為2.061,說明抽提的總RNA完整性較好,純度高,雖然有少量被降解的跡象,仍然能夠滿足后續(xù)RT2PCR的要求。

    2.2 目的片段的擴增(圖2)

    圖2 RT2PCR擴增 bg l(a)和PCR擴增 E5(b)Fig.2 RT2PCRamplification of bgl(a)and PCR product of E5(b)

    由圖2可以看出,擴增出的bg l片段大小約為2600 bp,E5片段大小約為1200 bp,分別與理論值2583 bp及1192 bp相符,初步認定是目的基因。

    2.3 重組克隆載體的鑒定(圖3)

    圖3 pMD182T2bgl的 PCR驗證(a)和pMD182T2E5的雙酶切驗證(b)Fig.3 Identification of pMD182T2bgl by PCR(a)and pMD182T2E5 by double digestion(b)

    由圖3可以看出,經(jīng) PCR擴增后,pMD182T2bgl能夠得到與目的片段大小相符的特異性條帶,pMD182T2E5雙酶切后產(chǎn)生的兩個條帶分別與載體及目的片段大小相對應(yīng),表明bgl與E5已經(jīng)成功克隆至 T載體。

    2.4 bgl基因的序列測定及分析

    對鑒定正確的重組菌株進行測序,結(jié)果顯示bg l片段大小為2583 bp,其中 A 543個、T 579個、C 705個、G 756個、G+C為 56.56%。登錄 NCB I進行BLAST比對,結(jié)果顯示目的基因與4個分別來源于Aspergillus nigerNRRL3135(登錄號 FN430671.1)、A s3.350(DQ 655704.1)、zju22(FJ262991.1),CBS513.88(XM 001398779.1)菌株及一個Aspergil2lus niger未知菌株(EU 233788.1)的β2葡萄糖苷酶m RNA序列同源性高達99%,氨基酸序列同源性為99%。與CBS513.88相比,bg l核苷酸序列共有18處堿基不同,其中12處對應(yīng)的氨基酸序列未發(fā)生改變。

    Bause等[9]提出糖苷水解酶家族3中成熟肽的第261位氨基酸A sp(D261)作為該酶的催化親核位點是高度保守的,并且其周圍氨基酸VM SDW也是高度保守序列。以DNA為模板擴增的E5序列正是包含該活性位點的區(qū)域,測序結(jié)果表明其氨基酸序列特征與上述報道完全一致,將其與全長測序結(jié)果比對,外顯子5區(qū)域同源性達100%。

    第三個研究問題旨在探索把英語作為二語或外語學(xué)習(xí)的大學(xué)生的詞匯量與語言能力之間的相關(guān)性。相關(guān)性分析結(jié)果表明,除中高級水平受試者的控制產(chǎn)出性詞匯知識量與其語言能力存在相關(guān)性以外,其它各變量間并無顯著相關(guān)性。對此有兩種可能的解釋:一種可能性是測量工具本身,可能還沒有在不同的層次之間進行足夠的區(qū)分。另一種可能是因為學(xué)生的詞匯量非常接近。因此,這一結(jié)論排除了將詞匯量測試作為獨立評估工具,來作為我們這樣的教學(xué)背景下語言能力水平指標(biāo)的可能性。然而,詞匯量測試的結(jié)果也可用于教學(xué)目的。通過調(diào)查學(xué)生的二語或外語詞匯知識,將為學(xué)生提供一個更合適的教學(xué)計劃,以提高他們的詞匯能力。

    在 PROSITE數(shù)據(jù)庫中(http://www.expasy.o rg/p rosite)搜索目的蛋白功能結(jié)構(gòu)位點,結(jié)果表明其成熟肽(去除1~19信號肽序列)247~264位序列為LL KAELGFQGFVM SDWAA,其中第 261位為 A sp(D),與文獻報道相一致,進一步表明該酶是糖苷水解酶家族3成員。在線采用 PROTPARAM程序(ht2 tp://expasy.org/cgi2bin/p rotparam)預(yù)測其編碼蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果表明其可編碼860個氨基酸的蛋白質(zhì),目的蛋白大小預(yù)計為93.3 kD,理論p I值為4.60,酸性氨基酸殘基總數(shù)(A sp+Glu)為100,堿性氨基酸(A rg+Lys)為60,表明其為酸性蛋白質(zhì)。20種氨基酸中甘氨酸(Gly)含量最高,為10.5%;丙氨酸(A la)次之,為9.7%。

    2.5 重組表達載體的酶切鑒定(圖4)

    圖 4 pET32a(+)2bgl(a)和 pET32a(+)2E5、pET28a(+)2E5(b)的雙酶切驗證Fig.4 Identification of pET32a(+)2bgl(a)and pET32a(+)2E5,pET28a(+)2E5(b)by double digestion

    由圖4可以看出,經(jīng)BamH I及N otI雙酶切后,三個重組質(zhì)粒均能獲得兩個特異性條帶,大小分別與目的片段及載體相符,表明目的基因已成功構(gòu)建到表達載體。

    2.6 重組蛋白的表達

    經(jīng)優(yōu)化表達條件,最終獲得目的蛋白最優(yōu)誘導(dǎo)表達條件為:20℃下用0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達12 h。SDS2PAGE電泳結(jié)果顯示,含有p ET32a(+)2bg l、p ET32a(+)2E5、p ET28a(+)2E5 的重組菌能夠產(chǎn)生特異性條帶,形成分子量約為114 kD、63 kD及48.9 kD的目的蛋白,與理論值93.3 kD和43.6 kD有差異,這是由于p ET32a(+)、p ET28a(+)質(zhì)粒本身分別帶有 Trx和/或 His標(biāo)簽序列,其編碼的蛋白與目的蛋白融合表達的結(jié)果。而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌并沒有目的蛋白的表達。經(jīng) Gel2p ro軟件分析,BGL目的蛋白含量約占總蛋白的32.14%。

    經(jīng)超聲破碎之后,BGL蛋白大部分以包涵體形式存在于沉淀中,上清中只有少量蛋白表達,見圖5。

    M.Molecular massmarker 1,4,7,10.p ET28a(+)2E5誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后全菌體、上清、沉淀 2,5,8,11.p ET32a(+)2E5誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后全菌體、上清、沉淀 3,6,9,12.p ET32a(+)2bg l誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后全菌體、上清、沉淀

    3 結(jié)論

    (2)測序結(jié)果表明,bg l全長2583 bp,推測其可編碼一個860個氨基酸的蛋白質(zhì),與β2葡萄糖苷酶基因(XM 001398779.1)核苷酸序列同源性為99%,氨基酸序列同源性為99%,屬于糖苷水解酶家族3,DNA上E5序列與bg l外顯子5部分同源性達100%。

    (3)將重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達,能夠成功獲得與預(yù)期大小相一致的融合蛋白。經(jīng)超聲破碎后,BGL蛋白大多以包涵體形式存在,上清中僅有少量蛋白,E5蛋白則完全以包涵體形式存在于沉淀中。

    [1] Takashima S,Nakamura A,Hidaka M,et al.Molecular cloning and exp ression of the novel fungalβ2glucosidase genes fromHu2m icola griseaandTrichoderma reesei[J].J Biochem,1999,125(4):7282736.

    [2] Iwashita K,Nagahara T,Kimura H,et al.ThebglAgene ofAs2pergillus kaw achiiencodes both extracellular and cellw all2boundβ2glucosidases[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65(12):554625553.

    [3] Dharmawardhana D P,Ellis B E,Carlson J E.cDNA cloning and heterologous exp ression of coniferinβ2glucosidase[J].Plant Mo2 lecular Biology,1999,40(8):3652372.

    [4] Dan S,Marton I,Dekel M,et al.Cloning,exp ression,characteriza2 tion and nucleophile identification of family 3,Aspergillus niger β2glucosidase[J].The Journal of Biologicai Chemistry,2000,275(7):497324980.

    [5] 閆會平,吳興泉,陳士華,等.黑曲霉β2葡萄糖苷酶的基因克隆[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,27(1):39242.

    [6] 趙林果,周譚澈,李迅,等.黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析[J].化學(xué)與生物工程,2007,24(11):53257.

    [7] 祝長青,李艷紅,周輝,等.黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因的分離[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2007,41(1):1022107.

    [8] Dellaporta S L,Wood J,Hicks J B.A plant DNA minip repara2 tion:VersionⅡ[J].Plant Molecular Biology Repo rter,1983,1(4):19221.

    [9] Bause E,Legler G.Isolation and amino acid sequence of a hexade2 capep tide from the active site ofβ2glucosidase A 3 fromAspergil2lusw entii[J].Hoppe Seylers Z Physiol Chem,1974,355(4):4382 442.

    Clon ing and Expression of Aspergillus N igerβ2Glucosidase Gene in Escherichia Coli

    ZHOU Xiao2m ing,MO Jun2ying,TAO Ye,FU Shui2lin,GONG Heng(State Key L ab of B ioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai200237,China)

    Acco rding to the sequence ofAspergillus nigerβ2glucosidase gene published in GenBank,two pairs of specific p rimers were designed and synthesized.Using the total RNA and genome DNA ofAspergillus nigerH7 as template,bg lgene and exon 5 sequence were amp lified.PCR p roduct were then cloned into pMD182T vector and sequenced,the results showed the nucleoside sequence ofbg lwas2583 bp,the homology of target gene and its deduced am ino acid sequence to the published could reach 99%and 99%,respectively.E5 sequence w as 100%identical to the exon 5 region ofbg l.Then the exp ression vecto rs p ET32a(+)2bg l,p ET32a(+)2E5,p ET28a(+)2E5 w ere constructed and transfo rmed intoEscherichia coliBL 21(DE3).The recom bi2 nant strains w ere induced by 1 mmo l·L-1IPTG and the target p roteins w ere analyzed by SDS2PA GE.

    Aspergillus niger;β2glucosidase;sequence analysis;p rotein exp ression

    Q 786

    A

    1672-5425(2010)06-0050-04

    2010-04-12

    周曉明(1985-),女,江蘇連云港人,碩士研究生,研究方向:分子生物學(xué);通訊作者:宮衡,教授。E2mail:gongheng@ec2 ust.edu.cn。

    猜你喜歡
    黑曲霉糖苷酶克隆
    克隆狼
    浙江:誕生首批體細胞克隆豬
    知母中4種成分及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:58
    木蝴蝶提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:32
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    復(fù)合誘變選育耐高溫高產(chǎn)葡萄糖酸鹽的黑曲霉菌株
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:22
    黑曲霉產(chǎn)纖維素酶混合發(fā)酵條件的研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:20
    酶法制備黑曲霉原生質(zhì)體的條件
    Galectin-7多克隆抗體的制備與鑒定
    六種花提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究
    日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲图色成人| 精品欧美国产一区二区三| 久久中文看片网| 久久这里只有精品中国| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久人妻av系列| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产精品成人久久小说 | av专区在线播放| 国产毛片a区久久久久| .国产精品久久| 免费av不卡在线播放| 日本黄大片高清| 久久99精品国语久久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 在线免费观看的www视频| 亚洲欧洲日产国产| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品久久久久久久末码| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩高清综合在线| 午夜爱爱视频在线播放| 国产69精品久久久久777片| 亚洲图色成人| 免费一级毛片在线播放高清视频| 18+在线观看网站| 欧美日本视频| 国产成人freesex在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲图色成人| 精品久久久噜噜| 真实男女啪啪啪动态图| 日韩欧美在线乱码| 日韩在线高清观看一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产久久久一区二区三区| 精品日产1卡2卡| 直男gayav资源| 国产日韩欧美在线精品| 国产欧美日韩精品一区二区| 色5月婷婷丁香| 老熟妇乱子伦视频在线观看| h日本视频在线播放| 国产在线男女| 国产日本99.免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久久久伊人网av| 天堂√8在线中文| 亚洲美女视频黄频| 中文字幕制服av| 亚洲av免费高清在线观看| 国产黄a三级三级三级人| АⅤ资源中文在线天堂| 性色avwww在线观看| 国产精品蜜桃在线观看 | 婷婷精品国产亚洲av| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 在线观看66精品国产| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久亚洲精品不卡| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品嫩草影院av在线观看| 免费在线观看成人毛片| 一本精品99久久精品77| 看免费成人av毛片| 免费无遮挡裸体视频| 1000部很黄的大片| 91av网一区二区| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美bdsm另类| 国产精品一及| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲最大成人av| 午夜福利在线观看吧| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 精品日产1卡2卡| 免费一级毛片在线播放高清视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 小说图片视频综合网站| 此物有八面人人有两片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 有码 亚洲区| 欧美激情在线99| 亚洲av电影不卡..在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 人体艺术视频欧美日本| 男女边吃奶边做爰视频| 久久精品久久久久久久性| 久久鲁丝午夜福利片| 少妇丰满av| 午夜福利在线观看吧| 男女那种视频在线观看| 此物有八面人人有两片| 欧美成人a在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 久久精品91蜜桃| 国产成人精品婷婷| 久久99热6这里只有精品| 成人永久免费在线观看视频| 99久久精品热视频| 99久国产av精品国产电影| 国产精品野战在线观看| 国产不卡一卡二| videossex国产| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美精品一区二区大全| а√天堂www在线а√下载| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美丝袜亚洲另类| 国产黄片美女视频| 成年女人永久免费观看视频| 特大巨黑吊av在线直播| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲av免费在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产成人a∨麻豆精品| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲最大成人av| 国产精品久久久久久久久免| .国产精品久久| 精品午夜福利在线看| 国产精品一区www在线观看| 97超碰精品成人国产| 精品人妻视频免费看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久久精品欧美日韩精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 国语自产精品视频在线第100页| 国产成人91sexporn| 久久午夜亚洲精品久久| 免费av观看视频| 久久国产乱子免费精品| 春色校园在线视频观看| av在线亚洲专区| avwww免费| 插阴视频在线观看视频| 国产亚洲精品av在线| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 插阴视频在线观看视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 免费电影在线观看免费观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 悠悠久久av| or卡值多少钱| av在线老鸭窝| 国产 一区精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 可以在线观看毛片的网站| 只有这里有精品99| 夜夜爽天天搞| 国产高清三级在线| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区二区在线观看日韩| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美日韩乱码在线| 亚洲国产精品国产精品| 久久久午夜欧美精品| 日韩av在线大香蕉| 国产精品野战在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 91精品国产九色| av天堂中文字幕网| 国产av不卡久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 一个人看的www免费观看视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费观看在线日韩| 99久久成人亚洲精品观看| 久久鲁丝午夜福利片| 深夜精品福利| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日本av手机在线免费观看| 久久人妻av系列| 午夜福利高清视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲美女视频黄频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 熟女电影av网| 综合色丁香网| 午夜久久久久精精品| 久久精品人妻少妇| 毛片女人毛片| 色综合色国产| 一级毛片久久久久久久久女| 日韩一区二区视频免费看| av免费观看日本| 国产精品久久视频播放| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲精品色激情综合| 欧美色欧美亚洲另类二区| 婷婷精品国产亚洲av| 久久久精品94久久精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 村上凉子中文字幕在线| 国产美女午夜福利| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费大片18禁| 成人美女网站在线观看视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 日本黄大片高清| 两个人视频免费观看高清| 成人一区二区视频在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 美女高潮的动态| 高清午夜精品一区二区三区 | 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 欧美成人免费av一区二区三区| 日本黄大片高清| 亚洲av熟女| 看片在线看免费视频| 精品一区二区免费观看| 人妻久久中文字幕网| 悠悠久久av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 不卡视频在线观看欧美| 综合色av麻豆| 国内精品久久久久精免费| 精华霜和精华液先用哪个| 日韩亚洲欧美综合| 插逼视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 男人舔奶头视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 黄色一级大片看看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 精品久久久久久久久久免费视频| 草草在线视频免费看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 日韩av在线大香蕉| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久久久久大av| 免费看日本二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲五月天丁香| 午夜视频国产福利| 99在线人妻在线中文字幕| 中文字幕免费在线视频6| 大型黄色视频在线免费观看| 免费观看的影片在线观看| 黄色一级大片看看| 国产黄色小视频在线观看| 中文字幕久久专区| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲人成网站在线播| 亚洲精品自拍成人| 亚洲成人久久爱视频| 国产熟女欧美一区二区| 男女视频在线观看网站免费| 内射极品少妇av片p| 久久久久久国产a免费观看| 午夜久久久久精精品| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久久网色| 高清午夜精品一区二区三区 | av在线蜜桃| 国产成人a∨麻豆精品| av在线亚洲专区| 精品久久久久久久久av| 欧美一级a爱片免费观看看| 男女下面进入的视频免费午夜| 青春草国产在线视频 | 日韩高清综合在线| av天堂中文字幕网| 一个人观看的视频www高清免费观看| 日韩成人伦理影院| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲人成网站高清观看| 免费av毛片视频| 婷婷色av中文字幕| 日日啪夜夜撸| 少妇熟女欧美另类| 神马国产精品三级电影在线观看| 三级毛片av免费| 久久精品91蜜桃| 好男人视频免费观看在线| 欧美+日韩+精品| 国产一区二区激情短视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产真实伦视频高清在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 我的老师免费观看完整版| 一区二区三区免费毛片| av福利片在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲在久久综合| 亚洲最大成人av| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩精品有码人妻一区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| ponron亚洲| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美区成人在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 国产成人freesex在线| 国产精品精品国产色婷婷| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品一及| 国产高清三级在线| 亚洲自偷自拍三级| 成人综合一区亚洲| 哪里可以看免费的av片| 日韩大尺度精品在线看网址| 变态另类丝袜制服| 久久这里有精品视频免费| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 天天躁日日操中文字幕| 色综合色国产| 六月丁香七月| 久久久久久久久久久免费av| 精品久久久久久久末码| 在线观看免费视频日本深夜| 午夜福利在线观看吧| 三级经典国产精品| 美女内射精品一级片tv| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | avwww免费| 国产v大片淫在线免费观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲,欧美,日韩| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美高清成人免费视频www| 成年女人永久免费观看视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲精品国产成人久久av| 日本一本二区三区精品| 日韩三级伦理在线观看| 日本一本二区三区精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 久久久成人免费电影| 亚洲美女搞黄在线观看| 免费av毛片视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产成人91sexporn| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩精品有码人妻一区| 高清在线视频一区二区三区 | 国产精品三级大全| 青春草视频在线免费观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久这里有精品视频免费| 有码 亚洲区| 日韩一区二区视频免费看| 精品久久国产蜜桃| 日韩在线高清观看一区二区三区| 免费观看人在逋| 亚洲在久久综合| 嫩草影院新地址| 日韩国内少妇激情av| 日本av手机在线免费观看| 内射极品少妇av片p| 一夜夜www| 成人高潮视频无遮挡免费网站| а√天堂www在线а√下载| 亚洲最大成人中文| 美女内射精品一级片tv| 免费观看在线日韩| 久99久视频精品免费| 日韩一本色道免费dvd| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美又色又爽又黄视频| 一级av片app| 亚洲欧美日韩无卡精品| 晚上一个人看的免费电影| 少妇丰满av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产不卡一卡二| 九九爱精品视频在线观看| 精品一区二区免费观看| 国产成人a区在线观看| 长腿黑丝高跟| 国产在线男女| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产伦一二天堂av在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲欧美日韩东京热| 一区二区三区四区激情视频 | 成人性生交大片免费视频hd| av天堂在线播放| 国产视频内射| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产av一区在线观看免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲在线自拍视频| 精品久久国产蜜桃| 亚洲性久久影院| 欧美日韩乱码在线| 国语自产精品视频在线第100页| 97热精品久久久久久| 久久精品91蜜桃| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品久久久久久精品电影| 真实男女啪啪啪动态图| 久久久久久国产a免费观看| 国产亚洲精品av在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 日韩高清综合在线| ponron亚洲| 日韩一区二区三区影片| 美女大奶头视频| 高清毛片免费看| 日韩欧美三级三区| 国产午夜精品一二区理论片| 嫩草影院新地址| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 悠悠久久av| 麻豆乱淫一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 国产av一区在线观看免费| 国产成年人精品一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲最大成人av| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美精品国产亚洲| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲av熟女| 国产熟女欧美一区二区| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 超碰av人人做人人爽久久| 免费看光身美女| 91在线精品国自产拍蜜月| 午夜视频国产福利| 国产黄a三级三级三级人| 久久午夜福利片| 91精品国产九色| 国产精品综合久久久久久久免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 在线播放无遮挡| 国产亚洲91精品色在线| 欧美日本视频| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲成人av在线免费| 国产片特级美女逼逼视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久精品国产清高在天天线| av专区在线播放| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 99久国产av精品国产电影| 高清在线视频一区二区三区 | 一区二区三区高清视频在线| 嫩草影院新地址| 内射极品少妇av片p| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日本欧美国产在线视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲图色成人| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 在线观看午夜福利视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 女人被狂操c到高潮| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品久久久久久久久久免费视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 成人无遮挡网站| 国产乱人视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 黑人高潮一二区| 国产亚洲精品av在线| 天天躁日日操中文字幕| 悠悠久久av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲综合色惰| 少妇的逼水好多| 卡戴珊不雅视频在线播放| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久国产成人精品二区| 国产精品一及| 日韩欧美在线乱码| 国产成人a∨麻豆精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 嘟嘟电影网在线观看| 99热只有精品国产| 国产亚洲精品av在线| 亚洲高清免费不卡视频| 久久久久久九九精品二区国产| 如何舔出高潮| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产综合懂色| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品不卡视频一区二区| 成人漫画全彩无遮挡| 国产成人一区二区在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日本在线视频免费播放| 欧美一区二区国产精品久久精品| 大香蕉久久网| 一本一本综合久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美性感艳星| 全区人妻精品视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 草草在线视频免费看| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲五月天丁香| 亚洲精品亚洲一区二区| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品国产成人久久av| 波野结衣二区三区在线| 亚洲成人久久爱视频| 成人国产麻豆网| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 男女视频在线观看网站免费| 久久热精品热| 日本三级黄在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 午夜激情欧美在线| 国产成人福利小说| 黄色配什么色好看| 简卡轻食公司| 亚洲欧洲国产日韩| 国产av麻豆久久久久久久| 免费搜索国产男女视频| 日韩av不卡免费在线播放| 中出人妻视频一区二区| 一边亲一边摸免费视频| 看免费成人av毛片| 能在线免费观看的黄片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 中文字幕av在线有码专区| 97热精品久久久久久| 久久99精品国语久久久| 男女那种视频在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 我的老师免费观看完整版| 校园春色视频在线观看| 久久久精品94久久精品| 精品不卡国产一区二区三区| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久国产网址| 在线免费十八禁| 草草在线视频免费看| 国产亚洲精品av在线| 久久九九热精品免费| 精品久久久久久久久亚洲| 国产探花在线观看一区二区| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲真实伦在线观看| 老女人水多毛片| 亚洲七黄色美女视频| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲天堂国产精品一区在线| 午夜亚洲福利在线播放| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久久久久久久丰满| 深爱激情五月婷婷| 1000部很黄的大片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 精品日产1卡2卡| 亚洲无线在线观看| 欧美三级亚洲精品| 嘟嘟电影网在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 国产老妇女一区| 亚洲精品456在线播放app| 欧美精品国产亚洲| 国产黄片美女视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 一边亲一边摸免费视频| 日本成人三级电影网站| 99久国产av精品| a级毛片a级免费在线| 在线天堂最新版资源| 精品日产1卡2卡| 亚洲最大成人av| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品永久免费网站| 在线观看美女被高潮喷水网站| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲不卡免费看| 观看美女的网站| 国产免费一级a男人的天堂| 国产av一区在线观看免费| 嫩草影院新地址| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久久精品大字幕|