黑曲霉誘變產(chǎn)酶活性與稻殼中木聚糖定向酶解的研究

劉寶亮,曹桂萍

（常州工學(xué)院理學(xué)院,江蘇常州 213002）

黑曲霉誘變產(chǎn)酶活性與稻殼中木聚糖定向酶解的研究

劉寶亮,曹桂萍

（常州工學(xué)院理學(xué)院,江蘇常州 213002）

采用紫外線照射誘變黑曲霉,篩選出低纖維素酶活的木聚糖酶高產(chǎn)菌株,研究了最優(yōu)誘變條件,分析了誘變后黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的活性,測定了木聚糖酶對溫度和p H值的穩(wěn)定性。并初步探討了木聚糖濃度、加酶量對酶解的影響。結(jié)果表明,最優(yōu)誘變條件為：紫外照射功率40W、照射距離28 cm、誘變時間2.5 min;黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的最適溫度為50℃、最適p H值為4.2。木聚糖濃度對木聚糖的酶解沒有影響,加酶量對木聚糖的酶解有一定影響;在木聚糖濃度為30 g·L-1、加酶量為2%～5%時,酶解效果較好。

黑曲霉;誘變;木聚糖酶;低聚木糖

低聚木糖（Xylo2oligosaccharide）,又稱木寡糖,是由2～7個D2木糖以β21,42木糖苷鍵結(jié)合而構(gòu)成的低聚糖,是一種附加值高的功能性食品添加劑,其主要有效成分為木二糖。在日本,低聚木糖被認(rèn)為是最有前途的功能性低聚糖[1],已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用。

國內(nèi)外對木聚糖酶進(jìn)行了較多的研究,已報道從黑曲霉[2,3]、海棗曲霉[4]、木霉[5]、短小芽孢桿菌[6]、梭狀芽孢桿菌[7]、鏈霉菌[8]的培養(yǎng)液中純化得到木聚糖酶。鑒于絲狀真菌產(chǎn)酶的特點(diǎn),如產(chǎn)生木聚糖酶胞外酶,便于酶的分離提取;產(chǎn)木聚糖酶的水平比一般細(xì)菌和酵母菌高;可以同時產(chǎn)生降解木聚糖支鏈所需的幾種輔助酶等,便于工業(yè)化應(yīng)用,因而對絲狀真菌,尤其是曲霉屬和木霉屬的研究較多[9,10]。低聚木糖生產(chǎn)用酶要求不含β2木糖苷酶或β2木糖苷酶活性低。由于木聚糖總是伴隨著纖維素共存的,自然界中只產(chǎn)木聚糖酶或只產(chǎn)內(nèi)切木聚糖酶的菌種較少,因此,基因突變是從自然界中獲得低纖維素酶活的木聚糖酶或無（低）β2木糖苷酶活木聚糖酶優(yōu)良菌株的重要方法。

作者在此采用紫外線照射誘變黑曲霉,篩選出低纖維素酶活的木聚糖酶高產(chǎn)菌株,分析了誘變后產(chǎn)木聚糖酶的活性,并對木聚糖酶定向酶解木聚糖進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料、試劑及儀器

稻殼,市售;黑曲霉（A.niger）,哈爾濱市微生物研究所。

所用試劑均為市售分析純。

MJ2160B2Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱、SPX21502Z型振蕩培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠;潔凈操作臺,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電熱手提式壓力蒸汽消毒器,哈爾濱市松花江醫(yī)療器械廠;顯微鏡;離心機(jī)。

1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

（2）平板培養(yǎng)基：以木聚糖粗提物10%作為碳源,取代察氏培養(yǎng)基中蔗糖,再加0.2%的膽酸鈉。

（3）搖瓶培養(yǎng)基：改進(jìn)M andels培養(yǎng)基。

斜面得平板培養(yǎng)溫度：32℃。

1.3 黑曲霉的誘變

1.3.1 誘變步驟

出發(fā)菌株→增殖培養(yǎng)→新鮮斜面菌種→孢子懸液濃度調(diào)至5×106個·mL-1→紫外線照射→稀釋涂粗木聚糖平板→挑選大的菌株→搖瓶初篩→復(fù)篩→高產(chǎn)菌株。

1.3.2 最佳誘變條件的確定

將培養(yǎng)7 d的黑曲霉孢子斜面加入適量的無菌水,刮下孢子置于盛有玻璃珠的三角瓶中,在往復(fù)式搖床上振蕩0.5 h（200 r·min-1）,使孢子分散,稀釋成1×106～1×107個·mL-1孢子懸液;將孢子懸液均勻鋪于已滅菌的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中,成1 mm左右的薄層;于40 W紫外燈下,距離28 cm處照射2～5 min;稀釋成一定的濃度梯度,涂布于PDA培養(yǎng)基上,28～30℃避光培養(yǎng)3～4 d,將誘變前后的稀釋液平板計數(shù),以致死率在85%的誘變條件為最佳。

1.4 黑曲霉誘變產(chǎn)酶活性的測定

采用DNS（3,52二硝基水楊酸）法測定酶活。以自制木聚糖為底物,以1 mg·m L-1木糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

（1）酶液制備：將誘變后的孢子在斜面培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng),用無菌蒸餾水制成孢子懸液,然后接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,于28℃培養(yǎng)120 h后,于 4000 r·min-1離心10～20 min,即得供試酶液。

（2）酶活測定：移取1.8 mL木聚糖底物于25 mL具塞試管中,于40℃保溫5 min;加入0.2 mL酶液,于40℃反應(yīng)20 min;立即加入3 m L DNS試劑,混合均勻,于沸水浴中保溫5 min,顯色;用冷水迅速冷卻后,加入20 m L蒸餾水,混勻,測定480 nm處的光吸收值。空白管則先加0.2 m L酶液,于沸水浴中保溫5 min,使酶失活后,再加3 m L DNS試劑和1.8 m L木聚糖底物,混合均勻,于沸水浴中顯色5 min,用冷水迅速冷卻后,加入20 mL蒸餾水,混合均勻。

（3）酶活力單位：在40℃和p H值4.8的條件下,每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需酶量定義為1個酶活力單位。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液用緩沖溶液稀釋成0 mg·m L-1、0.1 mg·m L-1、0.2 mg ·m L-1、0.3 mg ·m L-1、0.4 m g ·m L-1、0.5 m g ·m L-1、0.6 mg ·m L-1、0.7 m g ·m L-1、0.8 m g·m L-1標(biāo)準(zhǔn)木糖稀釋液,設(shè)3個重復(fù)。其中以0 m g·m L-1木糖為空白對照,分別取0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)木糖稀釋液于25 m L具塞試管中,加入1.8 m L木聚糖底物,40℃保溫20 min;加入3 m L DNS試劑,混合均勻,于沸水浴中保溫5 min,顯色;用冷水迅速冷卻后,加入20 m L蒸餾水,混勻,測定480 nm處的光吸收值,繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of xylose

（5）黑曲霉誘變產(chǎn)木聚糖酶的性質(zhì)測定：分別在p H值3.0～7.0保溫 4 h、在 30～80℃保溫 1 h,用DNS法測酶活。

1.5 木聚糖的酶解

（1）以木聚糖為原料,采用木聚糖酶定向酶解木聚糖制備低聚木糖。酶解條件為：木聚糖濃度20～50 g·L-1、酶液用量1%～10%,在p H 值為4～6、溫度為40～50℃條件下水解4～24 h。取少量水解液經(jīng)適當(dāng)稀釋,用DNS法測定還原糖濃度。

（2）取發(fā)酵液調(diào)p H值至中性,濾去不溶物,清液以DNS法測木糖質(zhì)量;再用8%的硫酸于121℃水解1 h,經(jīng)中和后以DNS法測木糖質(zhì)量。酸解后與酸解前木糖質(zhì)量的比值即為低聚木糖聚合度,酸解后木糖質(zhì)量除以總木聚糖質(zhì)量即得低聚木糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉紫外誘變條件的確定

2.1.1 紫外線的誘變機(jī)理

紫外線之所以能夠殺菌或誘變,主要是紫外線的光譜與核酸（特別是DNA）的吸收光譜一致,DNA對254 nm的紫外線有強(qiáng)烈的吸收作用,所以DNA最易受紫外線的影響。DNA吸收紫外線后,可引起其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,其中最主要的是誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成（胸腺嘧啶二聚體多數(shù)是在一條DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶之間形成,也可能在兩條DNA鏈之間形成）;從而使DNA分子變形,并干擾了DNA復(fù)制堿基的配對關(guān)系,最終發(fā)生突變。2.1.2 最優(yōu)誘變條件的確定

因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室紫外燈的功率和照射距離是固定的,所以控制磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速,均勻攪拌黑曲霉懸浮液,通過調(diào)整紫外照射時間來確定黑曲霉的最佳照射強(qiáng)度。菌落誘變的最佳照射強(qiáng)度要求致死率在85%左右,即存活率約為15%。

將經(jīng)紫外線照射的1.47×106個·m L-1孢子懸液稀釋一定倍數(shù),涂平板,28℃培養(yǎng)2～3 d,取出,進(jìn)行菌落計數(shù),計算存活率,結(jié)果見表1。

表1 照射時間對菌體存活率的影響Tab11 Effect of irradiation time on fungus survival rate

由表1可知,隨著紫外照射時間的延長,存活率不斷下降;當(dāng)紫外照射時間為2.5 m in時,存活率最接近15%。因此,確定黑曲霉的最佳誘變時間為2.5 min。

確定最優(yōu)誘變條件為：紫外誘變時間2.5 m in、紫外照射功率40 W、紫外照射距離28 cm。

2.2 黑曲霉誘變產(chǎn)木聚糖酶的活性

將1×106～1×107個·m L-1孢子懸液均勻地鋪于已滅菌的9 cm的培養(yǎng)皿中,成1 mm左右的薄層。于40 W紫外燈下,距離28 cm處照射2.5 min,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后,涂布于顯色篩選培養(yǎng)基平板上,28～30℃避光培養(yǎng)3～4 d,挑取透明圈大的菌落初步測定酶活性,選出木聚糖酶活力最大的誘變菌種。其中加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的膽酸鈉抑制菌落生長。

黑曲霉誘變產(chǎn)酶方法有固態(tài)培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩種方法。本實(shí)驗(yàn)采用液體培養(yǎng)的方法進(jìn)行黑曲霉誘變產(chǎn)酶,探討酶活性的影響因素。

2.2.1 溫度對酶活的影響

分別在 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃測同一酶樣的酶活力,結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對酶活的影響Fig.2 Effect of temperature on xylanase activity

由圖2可知,50℃時,黑曲霉誘變產(chǎn)木聚糖酶的相對酶活最大。因此,選擇50℃作為酶反應(yīng)的最佳溫度。

2.2.2 酶的熱穩(wěn)定性

分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中保溫1 h,測定酶活力,結(jié)果見圖3。

圖3 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性Fig.3 The xylanase stability to heat

由圖3可知,隨著溫度的升高,相對酶活逐漸降低;在50℃,相對酶活降低為原來的 46%;在 60～80℃時,木聚糖酶的活性基本消失。

2.2.3 p H值對酶活的影響

分別在 p H 值為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)溫度為50℃,測同一酶樣的酶活力,結(jié)果見圖4。

圖4 pH值對酶活的影響Fig.4 Effect of pH value on xylanase activity

由圖4可知,p H值為4.2時,黑曲霉誘變產(chǎn)木聚糖酶的相對酶活最大;p H值為4.0～5.0時,相對酶活超過80%;p H值大于5.5時,相對酶活下降很快。因此,選擇4.2作為酶反應(yīng)的最佳p H值。

2.2.4 酶的p H值穩(wěn)定性

分別在p H 值為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的緩沖溶液中,于35℃水浴中保溫4 h,測定酶活力,結(jié)果見圖5。

圖5 木聚糖酶的p H值穩(wěn)定性Fig.5 The xylanase stability to p H value

由圖5可知,p H值為4.0～6.0時,木聚糖酶比較穩(wěn)定,相對酶活在75%以上。

2.3 定向酶解的研究

木聚糖酶作用于木聚糖底物時,酶解效果會受到諸多因素的影響,主要表現(xiàn)在以下兩個方面：

2.3.1 酶系的組成

木聚糖從僅由β21,42糖苷鍵連接的多聚木糖線形分子到高分支的異質(zhì)多糖,其結(jié)構(gòu)變化很大。通常所能提取到的木聚糖均是高分支化的,包括42O2甲基2葡萄糖醛酸基、L2阿拉伯糖基等。酶解具有分支的木聚糖需要幾種水解酶的共同作用,主要包括β21,42木聚糖內(nèi)切酶和β21,42木糖苷酶。由于酶的來源不同,木聚糖酶的作用方式以及水解產(chǎn)物也不同。β21,42木聚糖內(nèi)切酶從木聚糖主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵,采用隨機(jī)降解的方式將木聚糖水解成低聚木糖。當(dāng)以聚合度較高的木聚糖為水解底物時,β21,42木聚糖內(nèi)切酶活力較高。然而隨著木聚糖鏈長的縮短,水解速度減慢。一般來說,木聚糖酶不水解木二糖,有限水解或根本不水解木三糖。因此,木聚糖的水解產(chǎn)物主要是木二糖、木三糖以及2～4個木糖殘基取代的低聚物。鏈長和有取代基的產(chǎn)物類型取決于每個木聚糖酶的作用方式。Dekker曾采用不同的木聚糖酶水解阿拉伯木聚糖和葡萄糖醛酸基木聚糖得到不同取代基的木聚糖。經(jīng)過比較,發(fā)現(xiàn)多數(shù)木聚糖酶降解木聚糖主鏈后,產(chǎn)生的低聚木糖在主鏈的非還原性末端留有取代基。這說明,取代基的存在可能對木聚糖酶具有空間阻遏作用。此外,還發(fā)現(xiàn)一些水解產(chǎn)物如木三糖對木聚糖酶活力有抑制作用。

β21,42木糖苷酶是外切糖苷酶,作用于低聚木糖的末端,釋放出木糖殘基。大多數(shù)微生物半纖維素系統(tǒng)都具有β21,42木糖苷酶活力,而且已從許多真菌和細(xì)菌合成的木聚糖酶中分離純化出該酶。一般認(rèn)為,純化得到的β21,42木糖苷酶對木聚糖不具有活性。雖然許多木聚糖酶都能水解木聚糖或低聚木糖釋放出木糖,但僅β21,42木糖苷酶能水解木二糖。

總之,酶系的組成直接影響到酶解速度和酶解產(chǎn)物。在低聚木糖的制備過程中,如果要獲得含高活力的木聚糖內(nèi)切酶且不含或僅含少量β21,42木糖苷酶的酶系,就需要通過一定的分離手段來達(dá)到這一要求。

2.3.2 酶解條件

從稻殼原料中提取的木聚糖堿液必須經(jīng)過預(yù)處理才能用于酶解。用98%的 H2SO4溶液中和堿液至p H值為8.0左右,產(chǎn)生絮凝狀沉淀,先用濾紙過濾,除去沉淀,再超濾去除Na2SO4鹽,即得濃縮脫鹽后的木聚糖液。

酶對底物的作用過程是一個生物轉(zhuǎn)化的過程,受酶用量、底物木聚糖的濃度、酶解時間、酶解p H值、酶解溫度的影響。在此,主要對底物木聚糖濃度和酶用量的影響進(jìn)行探討。

（1）底物濃度對酶解的影響（表2）

從表2可以看出,隨著木聚糖濃度的增加,酸解前木糖質(zhì)量沒有太大的變化,酸解后木糖質(zhì)量逐漸增加,但增加的比例并不是很明顯,聚合度逐漸增大,但是在木聚糖濃度為20～50 g·L-1時,平均聚合度沒有明顯的增加,在木聚糖濃度為30 g·L-1時,聚合度最大。因此,選擇濃度為30 g·L-1的木聚糖液進(jìn)行定向酶解木聚糖。

表2 底物濃度對酶解的影響Tab12 Effect of substrate concentration on enzymolysis

（2）加酶量對酶解的影響（表3）

表3 加酶量對酶解的影響Tab13 Effect of enzyme dosage on enzymolysis

從表3可以看出,隨著加酶量的增加,木糖質(zhì)量逐漸增加,聚合度逐漸降低。這是因?yàn)槟揪厶敲甘菑?fù)合酶,含有β21,42木糖苷酶,它能降解木二糖,因此,隨著木聚糖酶濃度的增加,低聚木糖的聚合度降低。綜合考慮,選擇加酶量為2%～5%,得到的低聚木糖聚合度為2～3,低聚木糖含量相差不大。

3 結(jié)論

（1）采用紫外照射誘變黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶,確定最佳誘變條件為：誘變時間2.5 min、紫外照射功率40 W、照射距離28 cm。

（2）采用DNS法測定木聚糖酶活性,篩選出了木聚糖酶活性最高的菌株,并對誘變后菌種產(chǎn)木聚糖酶的性質(zhì)進(jìn)行了測定。確定木聚糖酶的最適溫度為50℃,且溫度越低,酶活力保持時間越長;溫度越高,酶活力下降越快;在60～80℃時,酶活性基本消失。確定木聚糖酶的最適p H值為4.2,在木聚糖酶的p H值為4.0～6.0時,酶比較穩(wěn)定。

（3）木聚糖底物濃度對木聚糖的酶解沒有明顯影響;加酶量對木聚糖酶解有一定的影響,隨著加酶量的增加,木聚糖的聚合度逐漸減小。因此,在底物濃度一定的情況下,可以采用較少的加酶量進(jìn)行酶解。在木聚糖底物濃度為30 g·L-1、加酶量為2%～5%時,酶解效果較好。

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Study on Enzyme Activity of Xylanase from M utated Aspergillus N iger and Enzymolysis of Xylan in Paddy Hull

L IU Bao2liang,CAO Gui2ping
（School of Science,Changzhou Institute of Technology,Changzhou213002,China）

The strain p roducing high2yield xylanase w ith low enzymatic activity of cellulase was screened through mutation ofAspergillus nigerby UV2ray.The enzymatic activity of xylanase from mutatedAspergil2lus nigerw as analyzed.The xylanase stability to temperature and p H value w as determined.The effectsof xylan concentration and xylanase dosage on enzymolysis were discussed.The bestmutation conditionsofAspergillus nigerwere as follow s：UV power 40 W,distance 28 cm,irradiation time 2.5 min.The op timum conditions for p roduced xylanase were as follow s：temperature 50℃,p H value 4.2.The results showed that xylan concentra2 tion had no effect on enzymolysis,xylanase dosage affected enzymolysis obviously,the enzymolysis efficiency was the best w ith 30 g·L-1xylan concentration,2%～5%xylanase dosage.

Aspergillus niger;mutation;xylanase;xylo2oligosaccharide

Q 939 Q 814

A

1672-5425（2010）06-0073-05

2010-01-20

劉寶亮（1977-）,男,河北唐山人,講師,從事生物質(zhì)熱化學(xué)轉(zhuǎn)化利用和植物有效成分提取的研究。E2mail：lbliang1977@163.com。